Pseudoalteromonas sp. AJ5-913的κ-卡拉胶酶酶学性质及酶解产物分析

论文摘要

本论文目的是从海洋环境筛选高活性的κ-卡拉胶酶产生菌株,对筛选菌株的产酶培养条件和培养基进行优化,在此基础上对该菌株进行诱变以提高其酶活力,纯化其κ-卡拉胶酶,并研究该酶的酶学性质,利用此酶制备κ-卡拉胶寡糖,并对其酶解产物的组成和结构进行分析,为κ-卡拉胶酶酶制剂和κ-卡拉胶寡糖的工业化生产提供理论和技术支撑。通过富集培养技术、初筛和复筛方法从多种海藻和刺参肠道筛选出33株具有κ-卡拉胶降解活性的菌株,其中从刺参肠道筛选出的AJ5菌株产酶活力最高,为1.274 U/mL。依据形态学和生理学特征及16S rRNA基因序列分析,将该菌株鉴定为假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）,通过比较发现该菌株与已报道该属中的惟一一种产κ-卡拉胶酶菌P. carrageenovora有多种生理生化特征不同。通过单因素试验和正交试验对Pseudoalteromonas sp.AJ5菌株产胞外κ-卡拉胶酶的培养条件进行了优化。实验确定Pseudoalteromonas sp. AJ5菌株的最佳培养条件为:250 mL三角瓶装入75 mL发酵培养基、摇床转速150 r/min、接种量7%、pH8.0、培养温度28℃;最佳培养基组成为:κ-卡拉胶1 g/L、牛肉膏2 g/L、NaCl20 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、MnCl2·4H2O 0.2 g/L、FePO4·4H2O 0.01 g/L。以Pseudoalteromonas sp.AJ5菌株为出发菌株,经紫外线、甲基磺酸乙酯复合诱变和自然选育,获得一株酶活力显著提高的突变株Pseudoalteromonas sp.AJ5-913,发酵产酶活力达6.788 U/mL,比优化前提高了2.9倍。对该突变株进行液体发酵制备出κ-卡拉胶酶酶液,通过30%-80%硫酸铵分级沉淀、Sephadex G-200凝胶过滤层析和CM-纤维素52阳离子交换层析技术对κ-卡拉胶酶进行纯化和精制,获得电泳纯度的酶蛋白组份,SDS-PAGE确定此κ-卡拉胶酶的分子量为35 kDa。采用Edman降解法测得该酶的N端氨基酸序列为NPTCHIAKPGETTILQECRS,通过与已报道细菌κ-卡拉胶酶的N-末端氨基酸序列比较,没有发现与该酶同样的N-末端氨基酸序列,初步确定为一新κ-卡拉胶酶。采用等电聚焦电泳测得该酶的等电点pI为8.5。通过对该酶酶学性质研究,确定该酶反应的最适pH范围为8,且酶活力在pH6.6-8.6范围内比较稳定,最适温度为55℃,酶活力在28℃下稳定,但经50℃–75℃处理30 min,95%的酶活力丧失,最适NaCl浓度50 mmol/L,金属离子Zn2+, Co2+和Cu2+几乎完全抑制酶的活性。动力学参数测定结果表明,AJ5-913菌株的κ-卡拉胶酶水解κ-卡拉胶符合米氏动力学方程,采用双倒数法作图法求得其米氏常数Km值为9.8±0.2 mg/mL。AJ5-913菌株的κ-卡拉胶酶专门水解κ-卡拉胶,对τ-和λ-卡拉胶和琼脂糖没有水解作用。利用AJ5-913菌株所产的κ-卡拉胶酶对κ-卡拉胶进行酶解制备κ-卡拉胶寡糖,通过电喷雾离子化飞行时间质谱（ESI-TOF-MS）和13C-NMR分析该酶的水解产物,确定该κ-卡拉胶酶专门水解κ-卡拉胶3,6-内醚-D-半乳糖残基和4-硫酸基-D-半乳糖之间的β-1,4糖苷键,产生3,6-内醚-D-半乳糖作为非还原端,D-半乳糖作为还原端的κ-新卡拉寡糖,主要产物是κ-新卡拉二糖硫酸盐、κ-新卡拉四糖硫酸盐、κ-新卡拉六糖硫酸盐、κ-新卡拉八糖硫酸盐和κ-新卡拉十糖硫酸盐,与已报道细菌的κ-卡拉胶酶的酶解产物有所不同。寡糖的抗病毒活性实验显示,3.12μg/mL-200μg/mL的κ-新卡拉寡糖对单纯疱疹病毒1型（HSV-1）的吸附有抑制作用,并且呈现明显的量效关系,表明κ-新卡拉寡糖可干扰HSV-1毒株向Vero细胞的吸附。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 0 前言
• 1 卡拉胶的研究进展
• 2 卡拉胶及卡拉胶寡糖组成与结构的研究
• 3 卡拉胶酶的研究进展
• 4 卡拉胶及卡拉胶寡糖的生物学活性
• 参考文献
• 第二章 κ-卡拉胶降解菌株的筛选及鉴定
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第三章 Pseudoalteromonas sp.AJ5 菌株产κ-卡拉胶酶的培养条件优化及诱变选育
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第四章 Pseudoalteromonas sp.AJ5-913 κ-卡拉胶酶的分离纯化和基本酶学性质
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第五章 Pseudoalteromonas sp.AJ5-913κ-卡拉胶酶的酶解产物分析
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 第六章 κ-卡拉胶寡糖体外抗病毒活性的初步研究
• 0 引言
• 1 材料与方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 小结
• 参考文献
• 论文总结
• 后期工作设想
• 致谢
• 博士论文工作期间发表论文情况