枯草杆菌新型表达系统和遗传操作体系的建立及应用

论文摘要

枯草杆菌由于具有非致病性、分泌蛋白能力强的特性和良好的发酵基础，是目前原核表达系统中表达和分泌外源蛋白较理想的宿主。但由于受自身分泌蛋白酶多、构建的重组表达质粒不太稳定等因素影响，其应用受到一定的限制。近年来，随着分子生物学和基因工程的发展，枯草芽孢杆菌作为基因工程表达系统发展迅速，并展现出良好的应用前景。本文旨在建立一套枯草杆菌高效表达和分泌系统，实现甲基对硫磷水解酶基因mpd在枯草杆菌中的高效表达和分泌，以解决其在原始菌株中表达存在的一些问题；同时本文亦对枯草杆菌同源重组和载体转化等遗传操作体系进行了一些探索性研究。 以mpd基因为报告基因，构建了一个新型的方便而高效的启动子探针pUC-mpd。构建了枯草杆菌168的基因组DNA的启动子文库，利用启动子探针从文库中克隆了一系列启动子功能片段并比较了其在大肠杆菌中的启动子强度，得到了两个克隆有强启动子片段的克隆pMPDP3和pMPDP29。测定并分析了重组载体pMPDP3和pMPDP29克隆到的两个强启动子功能片段的序列，分别为两个功能未知基因ytkA和ywoF基因上游的启动子，mpd基因分别与ytkA和ywoF基因的信号肽编码序列发生了融合表达。对两个启动子的结构及两个基因与MPH的融合表达产物进行了预测和分析。ytkA基因表达产物的信号肽为脂蛋白信号肽，而ywoF基因表达产物的信号肽为分泌型信号肽。 利用大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体pNW33N与mpd基因构建了穿梭启动子探针pNW33N-mpd。利用该探针钓取启动子后可以不经亚克隆而直接转入枯草杆菌测定和比较启动子的强弱。利用穿梭启动子探针重新克隆了ytkA和ywoF基因的启动子与信号肽编码序列，构建了mpd基因穿梭表达载体pNYTM和pNYWM。将载体pNYTM和pNYWM转入枯草杆菌1A751重组表达mpd基因。发现在枯草杆菌中，ytkA基因的启动子强度远强于ywoF基因的启动子。1A751（pNYTM）的mpd重组表达产物与细胞结合，而1A751（pNYWM）的mpd重组表达产物大部分分泌在发酵液上清中。利用ytkA基因的强启动子和nprB基因的分泌型信号肽重新构建了mpd基因的分泌表达载体pYNMK。将pYNMK转入缺失了8种蛋白酶的枯草杆菌WB800，使mpd基因获得了更高水平的分泌表达，91.4％的酶分泌在上清液中，表达量是出发菌株的10.8倍。 进而利用PCR方法克隆和融合了P43启动子功能片段和nprB基因信号肽编码序列，构建了新的大肠杆菌-枯草杆菌分泌表达载体pP43NMK。将pP43NMK导入到枯

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩略语说明
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1 芽孢杆菌表达系统发展简史
• 2 芽孢杆菌表达系统概述
• 2.1 芽孢杆菌表达系统的特点
• 2.2 芽孢杆菌表达系统的宿主菌株
• 2.2.1 枯草杆菌宿主菌株
• 2.2.2 短短小芽孢杆菌宿主菌株
• 2.2.3 可作为宿主的其他种
• 2.3 芽孢杆菌表达系统的载体
• 2.3.1 自主复制载体
• 2.3.2 染色体整合载体
• 2.3.3 噬菌体载体
• 2.3.4 芽孢杆菌载体举例
• 2.4 芽孢杆菌的转化方法概述
• 2.4.1 感受态转化
• 2.4.2 原生质体转化
• 2.4.3 碱金属离子转化法
• 2.4.4 电转化
• 2.4.5 质粒的其它转移方式
• 3 芽孢杆菌表达系统的基因表达概述
• 3.1 芽孢杆菌基因表达的特点
• 3.1.1 能够形成芽孢
• 3.1.2 多Sigma因子
• 3.1.3 启动子的特征
• 3.1.4 终止子
• 3.1.5 16S RNA 3’端序列
• 3.1.6 革兰氏染色与基因表达
• 3.1.7 外源蛋白的分泌表达
• 3.1.8 外源蛋白的细胞内表达
• 3.1.9 单基因受多调控基因调控
• 3.1.10 一个调控基因往往影响多个基因的表达
• 3.2 芽孢杆菌表达系统中已表达的基因
• 3.2.1 已表达的真核基因
• 3.2.2 已表达的原核基因
• 3.2.3 蛋白质工程
• 4 枯草杆菌表达系统存在问题及今后发展方向
• 4.1 关于表达真核基因方面
• 4.2 关于表达酶的方面
• 4.3 关于表达杀虫晶体蛋白（ICP）方面
• 4.4 关于致病菌炭疽芽孢杆菌方面
• 4.5 利用芽孢杆菌基因工程技术扩大和加强芽孢杆菌在各方面的应用
• 参考文献
• 第二章 枯草杆菌高效表达和分泌系统的建立及mpd基因的重组分泌表达
• 第一节 以mpd为报告基因的新型启动子探针载体的构建及应用
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株,质粒及培养基
• 1.2 酶、抗生素和化学试剂
• 1.3 大肠杆菌普通感受态细胞的制备及转化
• 1.4 质粒DNA的小量提取
• 1.5 质粒DNA的小量酶切
• 1.6 甲基对硫磷水解酶基因mpd的扩增
• 1.7 启动子探针的构建
• 1.8 枯草杆菌1A1基因组DNA的提取
• 1.9 枯草杆菌基因组DNA启动子文库的构建及启动子克隆
• 1.10 甲基对硫磷水解酶酶活力单位的定义及酶活测定
• 1.10.1 酶活力单位定义
• 1.10.2 酶活测定原理
• 1.10.3 酶活测定步骤
• 1.10.4 酶活的计算方法
• 1.11 启动子片段的测序和分析
• 2 结果与分析
• 2.1 mpd基因片断的扩增及启动子探针的构建
• 2.2 枯草杆菌基因组DNA的提取和部分酶切条件的建立
• 2.3 基因组DNA启动子基因文库的构建及强启动子片断的克隆
• 2.4 启动子片段的序列测定及分析
• 3 讨论
• 第二节 利用枯草杆菌ytkA和ywoF基因启动子与信号肽重组表达mpd基因
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 酶和引物
• 1.3 培养基
• 1.4 枯草杆菌感受态细胞的制备及转化
• 1.5 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析
• 1.5.1 聚丙烯酰胺凝胶的灌制
• 1.5.2 电泳
• 1.5.3 凝胶的染色及脱色
• 1.6 甲基对硫磷水解酶的酶谱（Zymogram）分析
• 1.7 mpd基因的克隆及穿梭启动子探针的构建
• 1.8 穿梭表达载体pNYTM和pNYWM的构建
• 1.9 枯草杆菌1A751表达菌株的构建
• 1.10 穿梭载体pUBC19的构建
• 1.11 利用ytkA启动子和nprB信号肽编码序列构建分泌表达载体
• 1.12 枯草杆菌WB800表达菌株的构建
• 1.13 甲基对硫磷水解酶（MPH）活性检测及活力测定
• 1.14 枯草杆菌表达菌株的发酵试验
• 1.15 重组表达MPH的SDS-PAGE检测和酶谱分析
• 2 结果与分析
• 2.1 穿梭启动子探针pNW33N-mpd的构建和鉴定
• 2.2 穿梭表达载体pNYTM和pNYWM的构建和转化
• 2.3 枯草杆菌表达菌株甲基对硫磷水解酶表达活性的定性检测
• 2.4 表达菌株B.subtilis 1A751（pNYTM）和1A751（pNYWM）的发酵试验
• 2.5 分泌表达载体pYNMK的构建和转化
• 2.6 表达菌株WB800（pYNMK）的发酵试验及重组MPH分析
• 3 讨论
• 43启动子和NprB信号肽编码序列构建高效分泌表达载体重组表达mpd基因'>第三节 利用P₄₃启动子和NprB信号肽编码序列构建高效分泌表达载体重组表达mpd基因
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 酶和引物
• 1.3 培养基
• 1.4 P43启动子与NprB信号肽编码序列的克隆及融合
• 1.5 穿梭分泌表达载体pP43NMK的构建
• 1.6 表达菌株WB800（pP43NMK）的构建
• 1.7 表达菌株WB800（pP43NMK）的摇瓶发酵试验
• 1.8 MPH的SDS-PAGE和酶谱分析
• 1.9 重组表达MPH的分离和纯化
• 1.9.1 样品的制备和预处理
• 1.9.2 二乙氨基-乙基-葡萄糖凝胶A-50（DEAE-Sephadex A-50）的预处理
• 1.9.3 装柱
• 1.9.4 加样及洗脱
• 1.9.5 收集
• 1.9.6 洗脱曲线的绘制
• 1.9.7 合并与浓缩
• 1.9.8 A-50凝胶的再生
• 1.9.9 MPH的电洗脱纯化
• 1.10 重组表达MPH的鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 穿梭表达载体pP43NMK的构建
• 2.2 MPH在WB800（pP43NMK）中的重组表达和分泌
• 2.3 重组表达MPH的酶谱分析
• 2.4 重组表达MPH的纯化和鉴定
• 3 讨论
• 本章小结
• 参考文献
• 第三章 短短小芽孢杆菌cwp基因强启动子的克隆及应用
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 酶和引物
• 1.3 培养基
• 1.4 短短小芽孢杆菌B15总DNA的提取
• 1.5 分子操作
• 1.6 细胞壁蛋白基因（cwp）启动子和信号肽编码保守序列的扩增
• 1.7 PCR产物的克隆和测序
• 1.8 甲基对硫磷水解酶基因（mpd）穿梭分泌表达载体的构建和转化
• 1.9 枯草杆菌表达菌株的构建
• 1.10 甲基对硫磷水解酶（MPH）活性检测及活力测定
• 1.11 枯草杆菌WB800（pP15MK）的发酵试验
• 2 结果和分析
• 2.1 启动子和信号肽编码序列的扩增,克隆及分析
• 2.2 甲基对硫磷水解酶基因穿梭分泌表达载体的构建
• 2.3 表达菌株甲基对硫磷水解酶表达活性的定性检测
• 2.4 表达菌株B.subtilis WB800（pP15MK）的发酵试验
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第四章 枯草杆菌新型通用无标记同源重组系统的建立及应用
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 酶和引物
• 1.3 培养基
• 1.4 淀粉酶活性的检测
• 1.5 分子生物学操作
• 1.6 载体pDGIEF的构建
• 1.7 载体pDGIEF-mpd的构建
• 1.8 载体pIEFBPR的构建
• 1.9 载体pIEFBPR-ID的构建
• 1.10 甲基对硫磷水解酶活性的检测
• 2 结果和分析
• 2.1 以mazF基因为反向筛选标记的同源重组载体pDGIEF的构建
• 2.2 MazF cassette的在枯草杆菌1A751染色体上的整合和删除
• 2.3 mpd基因在枯草杆菌BS752S中的整合表达
• 2.4 通用型同源重组整合载体的构建
• 2.5 枯草杆菌BS753S的bpr基因的in-frame删除
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第五章 pUB110衍生质粒在芽孢杆菌间的转移现象及其应用
• 1 材料和方法
• 1.1 菌株和质粒
• 1.2 培养基及试剂
• 1.3 枯草杆菌感受态细胞的制备
• 1.4 枯草杆菌质粒的提取
• 1.5 甲基对硫磷水解酶（MPH）活性检测
• 1.6 菌株胞外蛋白酶活性的检测
• 1.7 重组质粒的转移
• 2 结果和分析
• 2.1 pUB110衍生质粒在枯草杆菌之间的转移
• 2.2 mpd基因在野生芽孢杆菌中的表达
• 3 讨论
• 4 本章小结
• 参考文献
• 第六章 全文总结
• 1 全文研究内容总结、讨论与展望
• 2 本论文研究的主要创新点
• 附录
• 附录1 实验用培养基及分子生物学试剂
• 附录2 枯草杆菌普通化学感受态细胞制备用试剂
• 附录3 甲基对硫磷酶活测定所用仪器及试剂
• 附录4 相关载体序列
• 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 致谢