黄芪甲苷对糖尿病血管重构的保护作用及其相关机制研究

论文摘要

糖尿病血管并发症是糖尿病患者致死、致残的主要原因。作为糖尿病的共同特征，高血糖是参与导致糖尿病血管内皮细胞及平滑肌细胞功能损伤的不同发病机制及发病环节的一个独立的致病因素。血管重构（vascular remodeling，VR）是血管为适应内外环境变化而发生的结构和功能的适应性改变。高血糖，胰岛素抵抗，高胰岛素血症，内皮细胞功能紊乱，非酶促糖基化，脂质过氧化和脂质浸润，血液流变学及血流动力学异常等因素，对血管壁的急慢性刺激均可引起血管重构。血管重构是糖尿病大血管及微血管病变的始动环节及病理生理基础，它在糖尿病早期血管结构和功能异常及晚期并发症的作用日益引起关注。内皮细胞与平滑肌细胞是血管壁的主要构成成分与功能单位，动脉血管壁内皮功能损伤、平滑肌细胞增殖／凋亡比例失衡、表型改变等与血管重构密切相关，因此糖尿病患者在降血糖治疗的同时，改善内皮与平滑肌细胞的功能对预防和治疗血管并发症也同样重要。本论文结合高糖诱导的内皮与平滑肌细胞损伤模型综合评价药物对血管重构的作用。细胞阻抗分析技术能非标记、实时地反映细胞的生物学状态，本研究将基于细胞阻抗分析技术的实时细胞电子传感系统(RT-CESTM)应用于血管平滑肌细胞生长的研究，建立了高糖（25 mM）诱导的血管平滑肌细胞损伤模型和动态监测平滑肌细胞生长情况的方法。本研究实时地监测了细胞从贴附、伸展、增殖到融合，以及加入高糖刺激引起的电极阻抗的变化过程，揭示了高糖作用下平滑肌细胞生长的动态变化过程。将其与传统的WST-1细胞活性检测法进行了比较，验证了这种分析方法反映细胞数量的可靠性。此模型的建立对高血糖参与糖尿病血管损伤的发病机制研究和抗糖尿病血管并发症药物筛选评价有重要的指导意义。黄芪甲苷是中药黄芪的主要活性成分，是一种小分子量的皂苷。黄芪甲苷具有多种药理作用，包括抗糖尿病，心血管疾病及糖尿病肾病等。但是黄芪甲苷对糖尿病血管重构的影响及其作用机理还不清楚。我们观察了黄芪甲苷对高糖诱导的平滑肌细胞增殖活力及细胞凋亡的影响。结果显示，50μg／mL黄芪甲苷可显著降低平滑肌细胞的增殖活力（P＜0．01）并且使凋亡率显著增高（P＜0．01），表明黄芪甲苷可通过降低平滑肌细胞增殖活力和促使细胞凋亡来抑制平滑肌细胞的增殖。我们的结果提示抑制细胞DNA合成与抗凋亡蛋白Bcl-2表达可能是黄芪甲苷降低高糖诱导的平滑肌细胞的增殖，促进细胞凋亡的机制。另外，黄芪甲苷还可以通过促进α-SMA蛋白表达抑制平滑肌细胞去分化。PPAR-γ具有促进细胞分化，调节细胞周期等作用，我们的研究表明，黄芪甲苷具有促进平滑肌细胞PPAR-γ基因表达的作用，说明黄芪甲苷对高糖诱导的平滑肌细胞增殖的保护作用与PPAR-γ相关。为了进一步考察黄芪甲苷是否具有治疗糖尿病血管并发症的潜力，我们研究黄芪甲苷对内皮的保护作用。研究表明黄芪甲苷可改善高糖诱导的内皮屏障功能损伤，并剂量依赖性的减低TNF-α引起的内皮细胞功能损伤，包括抑制细胞代谢活性丧失和细胞凋亡，证明了它具有改善内皮功能、治疗糖尿病心血管并发症的潜力。综上，本研究得到以下新的发现与结果：（1）应用RT-CES动态地监测平滑肌细胞的生长过程，建立了高糖诱导的平滑肌细胞损伤实时监测模型，并将其与传统的WST-1细胞活性检测法进行了比较，验证了这种分析方法反映细胞数量的方法是可靠的。（2）我们的研究发现黄芪甲苷可能通过如下机制对内皮细胞及平滑肌细胞功能发挥保护作用：①通过抑制细胞周期进程降低平滑肌细胞增殖活力；②通过调节抗凋亡蛋白Bcl-2促进平滑肌细胞凋亡；③通过促进α-SMA蛋白表达调节平滑肌细胞的表型；④促进平滑肌细胞PPAR-γ基因表达；⑤改善高糖诱导的内皮屏障功能损伤；⑥抑制TNF-α引起的内皮细胞代谢活性丧失和凋亡。（3）结合高糖诱导的内皮与平滑肌细胞损伤模型综合评价了黄芪甲苷对糖尿病血管重构的作用。我们的结果表明黄芪甲苷对高糖诱导的内皮细胞及平滑肌细胞的功能损伤具有一定的保护作用，因而对糖尿病血管重构具有保护作用，在预防治疗糖尿病血管并发症方面具有一定的开发前景。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• Abstract
• 第一章 糖尿病血管并发症与血管重构
• 1.1 糖尿病分类
• 1.1.1 1型糖尿病
• 1.1.2 2型糖尿病
• 1.1.3 特殊类型糖尿病
• 1.1.4 妊娠糖尿病
• 1.2 糖尿病血管并发症与血管重构
• 1.2.1 糖尿病血管并发症概述
• 1.2.2 血管重构的概念
• 1.2.3 糖尿病血管重构的病理学特征及生物学过程
• 1.2.4 糖尿病血管重构机制
• 1.2.5 血管重构与常见糖尿病并发症
• 1.2.6 高糖对血管损伤的病理生理机制
• 第二章 2型糖尿病并发症药物的相关研究现状
• 2.1 抗2型糖尿病并发症的药物
• 2.1.1 醛糖还原酶抑制剂
• 2.1.2 蛋白非酶糖基化阻滞剂
• 2.1.3 生长因子拮抗剂
• 2.1.4 抗氧剂
• 2.1.5 血管紧张素转换酶抑制剂
• 2.1.6 蛋白激酶C抑制剂
• 2.2 天然药物治疗糖尿病并发症
• 2.2.1 抑制醛糖还原酶活性
• 2.2.2 抑制蛋白质非酶糖基化及其终产物的形成
• 2.2.3 胰岛素增敏作用
• 2.2.4 降血脂
• 2.2.5 抗氧化作用
• 2.3 本课题的研究背景、方法以及意义
• 2.3.1 研究背景
• 2.3.2 研究方法
• 2.3.3 研究目的及意义
• 第三章 血管平滑肌细胞高糖损伤模型的建立及阻抗分析技术实时监测细胞生长
• 3.1 概述
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 实验材料
• 3.2.2 血管平滑肌细胞培养和鉴定
• 3.2.3 葡萄糖刺激浓度的选择及高糖对平滑肌细胞增殖活力的影响
• 3.2.4 使用阻抗仪细胞浓度的选择
• 3.2.5 高糖对血管平滑肌细胞电阻抗的影响
• 3.2.6 结果统计
• 3.3 实验结果
• 3.3.1 原代细胞培养结果及鉴定
• 3.3.2 葡萄糖刺激浓度的选择
• 3.3.3 阻抗仪细胞浓度的选择
• 3.3.4 高糖对微电子传感器阵列上的平滑肌电阻抗的影响
• 3.4 分析与讨论
• 第四章 黄芪甲苷对血管平滑肌细胞增殖的影响及相关机制研究
• 4.1 概述
• 4.2 平滑肌细胞增殖和凋亡及相关机制探讨方法
• 4.2.1 细胞增殖活力检测方法
• 4.2.2 细胞凋亡检测的相关方法
• 4.2.3 细胞内钙离子检测的相关方法
• 4.3 材料与方法
• 4.3.1 实验材料
• 4.3.2 细胞电阻抗实时监测黄芪甲苷对平滑肌细胞增殖活力的影响
• 4.3.3 WST-1法检测黄芪甲苷对平滑肌细胞增殖活力的影响
• 4.3.4 黄芪甲苷对平滑肌细胞细胞周期的影响
• 4.3.5 黄芪甲苷对平滑肌细胞凋亡的形态学观察
• 4.3.6 黄芪甲苷对平滑肌细胞凋亡的影响
• 4.3.7 黄芪甲苷对平滑肌细胞线粒体膜电位检测的影响
• 4.3.8 黄芪甲苷对凋亡相关基因Bcl-2表达的影响
• 2+测定'>4.3.9 黄芪甲苷对平滑肌细胞内游离Ca²⁺测定
• 4.3.10 黄芪甲苷对表型标记蛋白α-Smooth Muscle actin表达的影响
• 4.3.11 药物对平滑肌细胞PPAR-γ基因表达影响的检测
• 4.3.12 结果统计
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 黄芪甲苷对平滑肌细胞增殖活力的影响
• 4.4.2 黄芪甲苷对平滑肌细胞细胞周期的影响
• 4.4.3 黄芪甲苷对平滑肌细胞凋亡的影响
• 4.4.4 黄芪甲苷对平滑肌细胞Bcl-2表达的影响
• 4.4.5 黄芪甲苷对表型标记蛋白α-Smooth Muscle actin表达的影响
• 2+的影响'>4.4.6 黄芪甲苷对平滑肌细胞细胞内Ca²⁺的影响
• 4.4.7 黄芪甲苷对平滑肌细胞细胞PPAR-γ基因表达的影响
• 4.5 分析与讨论
• 第五章 黄芪甲苷对内皮细胞的保护作用及相关机制研究
• 5.1 概述
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料
• 5.2.2 脐静脉内皮细胞培养
• 5.2.3 培养内皮细胞的鉴定
• 5.2.4 黄芪甲苷对高糖诱导的内皮细胞电阻抗改变的影响
• 5.2.5 黄芪甲苷对高糖诱导的内皮通透性改变的影响
• 5.2.6 黄芪甲苷对TNF-α诱导的内皮细胞代谢活性丧失的影响
• 5.2.7 黄芪甲苷对TNF-α诱导的内皮细胞凋亡的影响
• 2+升高的影响'>5.2.8 黄芪甲苷对TNF-α引起的内皮细胞内Ca²⁺升高的影响
• 5.2.9 结果统计
• 5.3 实验结果
• 5.3.1 内皮细胞的培养及鉴定
• 5.3.2 黄芪甲苷对高糖引起的内皮屏障功能障碍的保护作用
• 5.3.3 黄芪甲苷对TNF-α引起的内皮细胞活性丧失的影响
• 5.3.4 黄芪甲苷对TNF-α引起的内皮细胞凋亡的影响
• 2+升高的影响'>5.3.5 黄芪甲苷对TNF-α引起的内皮细胞内Ca²⁺升高的影响
• 5.4 分析与讨论
• 第六章 总结与展望
• 1.研究工作总结
• 2.进一步的工作展望
• 参考文献
• 博士期间相关论文发表情况