论文摘要
背景和目的慢性脑缺血是神经系统的一种常见病理状态，伴发于脑动脉硬化、血管性痴呆（Vascular dementia VD）、Binswanger病及Alzheimer’s病（AD）等多种疾病的病理过程中，发病早期以认知功能损害为主要表现，最终可导致持久或进展性的认知与神经功能障碍。大量研究证实，慢性脑缺血引起的神经元缺失、白质损害可导致认知功能障碍。海马是参与学习和记忆的重要结构，因此海马神经元缺失可引起学习和记忆能力受损。中枢胆碱能系统与学习记忆密切相关，研究表明作为该系统的标志酶—胆碱乙酰转移酶（Cholineacetyltransferase，CHAT）活性降低是导致学习记忆障碍的重要原因。学习记忆的神经解剖基础是突触结构的可塑性，而一氧化氮（NO）和突触素（synaptophysin，SYN）与神经突触的可塑性密切相关。流行病学资料表明，绝经前的女性比同年龄男性的卒中发生率低，且卒中的严重程度远低于同年龄男性和绝经后女性，但绝经后女性其卒中的发生率迅速增高。在对女性绝经后雌激素替代治疗的研究中发现，替代治疗可以使发生卒中的相对危险度下降，与卒中有关的死亡率亦下降。由此，人们推测雌激素具有脑保护作用。近几年来，科研工作者发现雌激素不仅降低脑损害的严重程度而且改善认知功能。但是在已有慢性脑灌注不足的情况下，雌激素有无保护作用，如何表现，目前研究较少。本试验旨在通过永久性结扎双侧颈总动脉即（2VO法）建立大鼠慢性脑缺血模型，经腹腔内注射雌激素，用MG-2Y型迷宫比较大鼠学习记忆能力，并通过免疫组化方法观察海马CA1区突触素、胆碱乙酰转移酶和神经型一氧化氮合酶（nNOS）表达的变化，初步探讨雌激素对慢性脑缺血认知功能影响的机制，为临床上预防及治疗与慢性脑缺血有关的疾病提供实验支持和理论依据。材料与方法1．实验动物分组：健康成年雌性SD大鼠30只，体重300—350g（河南实验动物中心提供）。随机分为三组：假手术组；单纯缺血组；缺血治疗组。每组10只。缺血治疗组大鼠卵巢切除术后当天开始腹腔注射苯甲酸雌二醇1mg／kg，（0.3ml）；假手术组和单纯缺血组大鼠术后给予煮沸冷却后的麻油（溶解雌二醇的溶剂）腹腔注射，每只0.3ml，以上三组均为每周腹腔注射2次（周一和周四），共60天；2．模型的制作：钝性分离单纯缺血组和缺血治疗组大鼠双侧颈总动脉，用0号手术线分别结扎其近心端及远心端，并从中间剪断；分离假手术组双侧颈总动脉但不结扎，也不剪断。间隔1周后，单纯缺血组和缺血治疗组行双侧卵巢切除术，假手术组大鼠行类似分离操作，但不切除卵巢，术后各组大鼠均在常规条件下饲养；3．标本的制作：手术后60天，通过Y—迷宫试验进行学习记忆能力测试，然后经心脏灌注，用4％的多聚甲醛固定后做石蜡切片，供HE染色及免疫组化用；4．观察指标：（1）认知能力：测试方法采用MG-Y型迷宫箱，训练大鼠按信号灯跑向安全通道。每次测试均在上午8:00-11:00进行。（2）HE染色：光镜下观察海马组织的病理变化。（3）用免疫组化法观察突触素、CHAT和nNOS的表达，并利用病理图像分析系统对SYN、CHAT免疫组化的阳性细胞数进行测定。5．统计方法：采用SPSS10.0统计软件进行数据处理，所有数据均采用均数±标准差（（?）±s）表示，多组均数间比较采用单因素方差分析。以α=0.05作为显著性检验水准。结果（1）一般情况：模型大鼠双侧颈总动脉完全阻断后，首先出现短暂惊厥，翻正反射消失，伴体温降低，呼吸减慢。术后5—7天各组爬行基本恢复，无明显运动障碍；（2）认知能力：各组大鼠错误反应次数如下：假手术组：34.50±7.29；单纯缺血组：81.67±11.02；缺血治疗组：60.83±15.90；单纯缺血组、缺血治疗组与假手术组相比，认知能力下降，错误次数明显增多（P＜0.01）；缺血治疗组与单纯缺血组相比也有明显差别，缺血治疗组较单纯缺血组的错误次数明显减少（P＜0.01）；（3）HE染色：假手术组偶有神经元细胞变性、死亡，大部分细胞形态未发现明显的病理变化，单纯缺血组见海马神经元的病理损害加重，CA1区锥体细胞层次减少，排列稀疏、紊乱，细胞脱失显著，细胞核体积小、深染，固缩为三角形或多角形，神经纤维排列紊乱，与单纯缺血组相比，缺血治疗组脑组织损害程度明显减轻；（4）各组大鼠脑海马组织CHAT的表达：应用图像分析系统分析CHAT阳性产物的平均灰度值，与假手术组比较，缺血组和缺血治疗组大鼠海马CA1区CHAT灰度值均有明显减少（P＜0.01）；与缺血治疗组比较，缺血组CHAT的灰度值下降更为明显（P＜0.01）：（5）各组大鼠脑海马组织突触素的表达：应用图像分析系统分析突触素阳性产物的平均灰度值，与假手术组比较，缺血组和缺血治疗组大鼠海马CA1区突触素的灰度值均有明显减少（P＜0.01）；与缺血组相比，治疗组突触素的灰度值明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；（6）nNOS的免疫组化：缺血组nNOS的阳性神经元明显低于其他各组（P＜0.01）；缺血治疗组脑内nNOS的表达较缺血组显著升高（P＜0.01）；结论（1）苯甲酸雌二醇可以改善慢性脑缺血大鼠的认知功能障碍；（2）苯甲酸雌二醇可以减轻慢性脑缺血大鼠海马CA1区神经元的损伤；（3）苯甲酸雌二醇可通过提高ACH、NO、突触素的含量改善慢性脑缺血大鼠的认知障碍。