RNA干扰技术阻遏NDRG2基因表达对宫颈癌Hela细胞化疗敏感性的调节作用

论文摘要

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一,发病率位于女性肿瘤第二位,占女性恶性肿瘤50%以上,全世界每年有20万妇女死于这种疾病,严重威胁女性健康。作为中晚期宫颈癌的常规标准治疗,放疗与含铂方案的化疗已广泛应用于临床。由于具有辐射抗性及化疗耐药的宫颈癌细胞的存在,目前宫颈癌的综合疗效仍然受限。因而,宫颈癌的分子生物学和肿瘤相关基因治疗的研究逐渐受到人们的重视。人源NDRG2 （又名SYLD或KIAA1248 ）是我室在1999年利用基于PCR的消减杂交技术进行神经胶质瘤与正常脑组织的基因表达差异时发现的一个低表达的新基因[GenBank登录号AF159092] [1],其mRNA全长为2024bp,编码一个含有357个氨基酸残基、分子量约41kDa的功能未知蛋白。该基因染色体定位在14q11.2,含有16个外显子,15个内含子。由于该基因在氨基酸序列上与已发现的N-myc下游基因NDRG1（N-myc down-stream regulated gene 1）具有较高的同源性,故将其命名为NDRG2。该基因在成人骨骼肌、脑和心肌中高表达,而在其他组织中低表达或不表达[2]。国内外其他实验室也相继报道了该基因。近些年来对NDRG2基因进行了大量的研究,但其功能到现在仍然没有明确。在前期研究中我们发现,降低NDRG2的表达可以增强γ射线辐照对宫颈癌Hela细胞生长的抑制作用并增强辐照诱导的细胞凋亡,提高Hela细胞的辐射敏感性,而升高NDRG2的表达水平可以增强Hela细胞在γ射线辐照下的克隆形成能力（见刘军叶博士后论文）。这就提示NDRG2基因参与了Hela细胞对γ射线辐射敏感性的调节,可能参与了肿瘤细胞DNA损伤后的应激反应。作为宫颈癌综合治疗的重要组成部分,肿瘤化疗常与放疗联合成为中晚期宫颈癌的常规标准治疗。作为联合化疗中最常用最有效的药物之一,顺铂通过与DNA形成链内及链间交叉连结,破坏DNA功能。如果NDRG2基因参与了肿瘤细胞DNA损伤后的应激反应,那麽它就有可能参与顺铂化疗敏感性的调节。为了验证上述推测,我们以宫颈癌Hela细胞系为研究对象,首先观察了顺铂作用对内源性NDRG2表达水平的影响,结果显示顺铂诱导Hela细胞DNA损伤后,内源性NDRG2表达水平出现逐渐增高的趋势。进而利用RNA干涉技术制备了NDRG2表达下调的稳转细胞系,四甲基偶氮唑蓝比色试验（MTT）结果显示,NDRG2表达下调的稳转细胞系较对照细胞其顺铂作用下IC50值明显降低;细胞平板克隆形成实验结果显示,在相同顺铂浓度作用下,下调NDRG2的表达明显降低了Hela细胞的克隆形成率;流式细胞检测结果显示,NDRG2基因特异性siRNA显著增强顺铂诱导的Hela细胞凋亡。为了降低稳转细胞系长期G418筛选压力对于细胞特性影响所造成的实验误差,我们利用小干涉RNA瞬时转染Hela细胞,对顺铂的药物敏感试验进行验证,结果同样提示下调NDRG2表达可以提高Hela细胞对顺铂的化疗敏感性。另外,在实验过程中,我们还发现下调NDRG2明显降低了Hela细胞的生长速度,进一步检测发现增殖性核抗原（PCNA）表达水平显著降低。综上所述,我们首次提出了NDRG2参与顺铂化疗敏感性调控的假设,并通过实验证实了在宫颈癌Hela细胞系中下调NDRG2表达可以提高对顺铂的化疗敏感性,结合前期对于NDRG2对宫颈癌Hela细胞辐射敏感性调节作用的研究进一步提示NDRG2可能成为一个新的宫颈癌治疗靶分子。NDRG2作为一个新基因,其发挥作用的具体功能成为研究的热点,本研究从化疗敏感性这一新的视角入手,使该基因的功能研究得以充实和完善。

论文目录

• 缩略语表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 文献回顾
• （一） 宫颈癌化疗敏感性相关基因的研究进展
• （二） NDRG2 的研究现状
• 正文
• 第一部分NDRG2 参与肿瘤细胞DNA损伤应激反应
• 1. 实验材料和主要仪器
• 1.1 试剂和细胞系
• 1.2 RT-PCR引物
• 1.3 仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 细胞培养及顺铂药物刺激
• 2.2 半定量RT-PCR
• 2.3 Western Blot
• 3. 实验结果
• 3.1 在mRNA水平，NDRG2 基因随顺铂刺激时间的延长而呈现峰值曲线样变化
• 3.2 在蛋白质水平，NDRG2 基因随顺铂刺激时间的延长而呈现峰值曲线样变化
• 4. 讨论
• 第二部分 NDRG2 参与了Hela细胞对顺铂化疗敏感性的调节
• 1. 实验材料和主要仪器
• 1.1 试剂和细胞系
• 1.2 Real-time PCR引物
• 1.3 仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 稳转细胞系NDRG2 表达水平鉴定
• 2.1.1 Real-time PCR
• 2.1.2 Western Blot
• 2.2 四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞对顺铂的5096抑制浓度
• 2.3 平板克隆形成实验检测细胞在顺铂作用下的克隆率
• 2.4 流式细胞术检测细胞在顺铂作用下的凋亡率
• 3. 实验结果
• 3.1 在mRNA水平，NDRG2 下调稳转细胞系Hela-nd1925iRNA及G7 细胞NDRG2 表达水平均较对照Hela-pSilencer明显降低
• 3.2 在蛋白水平，NDRG2 下调稳转细胞系Hela-nd1925iRNA及G7 细胞NDRG2 表达水平均较对照Hela-pSilencer明显降低
• 3.3 四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT比色法）结果显示抑制NDRG2 表达可以降低Hela细胞在顺铂作用下的体外存活率
• 3.4 抑制NDRG2 表达可以降低宫颈癌Hela细胞在顺铂作用下的克隆形成能力
• 3.5 抑制NDRG2 表达可以增加顺铂诱导的Hela细胞凋亡率
• 4. 讨论
• 第三部分 siRNA瞬时转染验证NDRG2 参与了Hela细胞对顺铂化疗敏感性的调节
• 1. 实验材料和主要仪器
• 1.1 试剂和细胞系
• 1.2 人NDRG2 基因特异性siRNA oligomer由美国Invitrogen 公司设 计并合成 NDRG2-HSS126268:
• 1.3 RT-PCR引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 NDRG2:
• 1.4 仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 细胞培养及瞬时转染
• 2.2 半定量RT-PCR
• 2.3 Western Blot
• 2.4 四甲基偶氮唑蓝比色法检测细胞对顺铂的5096抑制浓度
• 3. 实验结果
• 3.1 在mRNA水平，化学合成的三对NDRG2 基因特异性siRNA oligomer均可使Hela细胞的NDRG2 表达明显降低
• 3.2 在蛋白水平，化学合成的三对NDRG2 基因特异性siRNA oligomer均可使Hela细胞的NDRG2 表达降低
• 3.3 四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT比色法）结果显示抑制NDRG2 表达可以降低Hela细胞在顺铂作用下的体外存活率
• 4. 讨论
• 第四部分 NDRG2 参与Hela细胞对顺铂化疗敏感性的调节机制的探讨
• 1. 实验材料和主要仪器
• 1.1 试剂和细胞系
• 1.2 RT-PCR引物由北京奥科生物工程技术服务有限公司合成
• 1.3 仪器
• 2. 实验方法
• 2.1 细胞培养及瞬时转染
• 2.2 半定量RT-PCR
• 2.3 Western Blot
• 3. 实验结果
• 3.1 稳定转染细胞系与亲本细胞增殖细胞核抗原（PCNA）的变化
• 3.2 Hela、 Hela-nd1925iRNA细胞对于顺铂作用不同时相 P53 蛋白表达水平的变化
• 3.3 在蛋白水平，化学合成的三对NDRG2 基因特异性siRNA oligomer均可使Hela细胞的P53 表达增高
• 3.4 稳定转染细胞系与亲本细胞HPV18E6 RNA表达水平的变化
• 4. 讨论
• 小结
• 参考文献
• 个人简历和研究成果
• 致谢