荷斯坦奶牛细胞因子基因的克隆、表达及重组蛋白的应用

论文题目: 荷斯坦奶牛细胞因子基因的克隆、表达及重组蛋白的应用

论文类型: 博士论文

论文专业: 预防兽医学

作者: 张灿

导师: 汪明

关键词: 原核表达,免疫佐剂

文献来源: 中国农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 本研究从荷斯坦奶牛的外周血淋巴细胞中经ConA刺激提取总RNA,通过RT-PCR的方法克隆了IL-2、IL-6和GM-CSF三个基因,连接载体T-easy,测序结果显示:IL-2与已登录的基因序列完全相同;IL-6和GM-CSF与GneBank中的序列存在点变异。氨基酸序列分析表明三种细胞因子α螺旋在50%以上,有1-2个糖基化位点。 从PMD-18/VP1质粒中亚克隆FMDV抗原基因VP1,构建原核表达质粒pGEX-6p-1/VP1;亚克隆IL-2、IL-6和GM-CSF三个成熟肽基因,分别构建原核表达质粒pGEX-6p-1/BoIL-2,pGEX-6p-1/BOIL-6,pGEX-6p-1/BoGM-CSF;分别构建VP1基因与1-2个细胞因子基因共表达质粒 pGEX-6p-1/BolL-2/VP1,pGEX-6p-1/BolL-6/VP1,pGEX-6p-1/BoGM-CSF/VP,pGEX-6p-1/BoIL-2/IL-6/VP1,pGEX-6p-1/BoIL-2/GM-CSF/VP1,基因之间用linker连接,分别在大肠杆菌RS21中表达,30℃ IPTG诱导表达出相应蛋白:蛋白以包涵体的形式存在,表达量占菌体总蛋白的37%以上,纯化后蛋白纯度达到90%以上;生物活性测定结果表明,IL-2对小鼠的胸腺细胞有刺激活性,GM-CSF对小鼠的骨髓细胞有刺激活性。 将豚鼠随机分为17组,每组5只,将表达的重组蛋白免疫各组,每隔2周免疫一次,共免疫3次。每次免疫后2周采血分离血清,ELISA测定血清抗体效价;用中和抗体阻断试剂盒测定中和抗体:末次免疫后2周分离脾脏淋巴细胞,用MTT法进行T细胞增殖试验;通过半定量RT-PCR检测细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-5和IL-10表达水平;试验结束前三天进行迟发型超敏反应试验。豚鼠试验结果表明,与生理盐水对照组比较,免疫组血清IgG抗体水平显著升高,T细胞增殖反应显著增强,抗原特异性迟发型超敏反应(DHT)强烈,Th1型和Th2型细胞因子表达量都有不同程度的升高。各免疫组之间比较,两种细胞因子与VP1联用的融合蛋白和混合蛋白的四个免疫组免疫效果最好;单个细胞因子与VP1联用的六个免疫组效果次之,VP1、VP1+佐剂和灭活苗组与以上六组效果相当。在各免疫组中,共表达蛋白组和混合蛋白组免疫效果相当,没有明显的差别。中和试验结果表明,BOIL-2,BOIL-6组没有产生明显的中和抗体,其他各组都能刺激产生高水平的中和抗体;与VP1组比较,BoGM-CSF,BoIL-2/VP1,BolL-6/VP1,BoGM-CSF/VP,BoIL-2+VP1,BoIL-6+VP1,BoGM-CSF+VP,BoIL-2/IL-6/VP1,BoIL-2+BoIL-6/VP1,中和抗体水平较高,但没有达到显著差异,BoIL-2/GM-CSF/VP1,BoIL-2+BoGM-CSF/VP1免疫组中和抗体水平显著增高;与灭活苗组比较,BoIL-2/GM-CSF/VP1,BoIL-2+BoGM-CSF/VP1免疫组刺激产生的中和抗体滴度和灭活苗组中和抗体滴度相当。通过ELISA试验、T细胞增殖试验、中和抗体试验、迟发型超敏反应试验以及半定量PCR试验检测三种细胞因子作为分子免疫佐剂与VP1联用的效果,试验结果表明用VP1免疫,GM-CSF作为分子佐剂的效果最好:IL-2比IL-6的佐剂效果好;两种细胞因子联合的佐剂效果比单个细胞因子的佐剂效果好。

论文目录:

文献综述

文献综述一 细胞因子的研究进展

文献综述二 细胞因子免疫佐剂在口蹄疫基因工程苗中的应用

试验研究

第一部分 荷斯坦奶牛细胞因子基因的克隆及其序列分析

1.引言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

5.小结

第二部分 荷斯坦奶牛细胞因子的原核表达及生物活性分析

1.引言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

5.小结

第三部分 重组细胞因子对FMDV基因工程苗免疫效果的研究

1.引言

2.材料与方法

3.结果

4.讨论

5.小结

结论

参考文献

致谢

个人简介

附录

发布时间: 2005-07-18

参考文献

• [1].融合细胞因子影响HBV preS2S基因疫苗免疫效果的初步研究[D]. 陈红梅.第四军医大学2004
• [2].人TH2细胞因子对异种血管内皮细胞保护作用及其机制的实验研究[D]. 陈刚.第二军医大学2004
• [3].DC上表达的LSECtin对辅助性T细胞亚群分化的影响及其机制研究[D]. 赵殿元.中国人民解放军军事医学科学院2013
• [4].乳腺炎细胞因子及T淋巴细胞亚群研究[D]. 敬晓棋.西北农林科技大学2013
• [5].硒对山羊妊娠调节的细胞与分子免疫学机制[D]. 李引乾.西北农林科技大学2001
• [6].血吸虫病抗独特型抗体疫苗佐剂的研究[D]. 钟石根.南京医科大学2002
• [7].细胞因子白细胞介素-2的心血管效应共享阿片受体信号转导途径机制[D]. 曹春梅.浙江大学2002
• [8].耐药结核分枝杆菌感染的免疫治疗及艰难梭状芽孢杆菌毒素的结构域功能与病理研究[D]. 张雍容.华东理工大学2013
• [9].柔脑膜细胞具有神经干细胞特性的实验研究[D]. 王婷.第四军医大学2008
• [10].运输应激对猪免疫机能的影响及其调控机理初探[D]. 吕琼霞.南京农业大学2009

相关论文

• [1].牛IFN-α/γ基因的克隆、表达及重组蛋白的应用研究[D]. 史喜菊.中国农业大学2004
• [2].奶牛γ-干扰素基因的表达及其在乳房炎防治中的初步应用[D]. 许金俊.扬州大学2004
• [3].利用中国荷斯坦牛定位BTA6上影响产奶性状的QTLs[D]. 陈慧勇.中国农业大学2005
• [4].PRRSV GP4和GP5多表位串联基因的表达及在小鼠诱导的免疫反应[D]. 付利芝.中国农业大学2005
• [5].鸡干扰素与干扰素受体重组蛋白的生物学特性及其相互作用[D]. 韩春来.中国农业大学2005
• [6].犬瘟热病毒、犬冠状病毒入侵宿主细胞机制研究[D]. 柏亚铎.中国农业大学2005
• [7].奶牛蹄底溃疡发病机理和治疗试验研究[D]. 罗安智.中国农业大学2005
• [8].表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白重组质粒的构建及免疫效应[D]. 宋勤叶.中国农业大学2005
• [9].奶牛热应激的细胞免疫调控及其分子机理研究[D]. 蔡亚非.南京农业大学2005
• [10].围产期奶牛干物质摄入减少及脂肪动员的神经内分泌调控机制[D]. 牛淑玲.吉林大学2005

标签：原核表达论文;  免疫佐剂论文;