乙醇对斑马鱼早期胚胎发育的影响及其分子机制研究

论文摘要

妊娠期间摄入乙醇对胚胎发育有严重影响，胎儿酒精综合征（Fetal Alcohol Syndrome，FAS）是最主要的发育畸形，表现为头面部畸形、心血管系统发育障碍和永久性神经系统损伤。许多模式生物用于研究乙醇对胚胎发育的影响，但是不同的模式生物各有优缺点。斑马鱼作为模式生物，其发育过程与人类有很高的同源性，并具有发育周期快、胚体透明等优点，已广泛应用于发育遗传学和环境毒理学的研究。Laale等首先发现乙醇能引起斑马鱼独眼畸形。除此之外，乙醇的致畸作用所表现出的表型十分复杂，主要还包括心前区水肿、循环系统发育障碍、体轴发育畸形、双侧肝脏、前脑发育畸形等表型，但其具体分子机制仍然不明。1．乙醇干扰斑马鱼心血管系统的发育先天性心脏病和心血管发育畸形在FAS患儿中发生率接近50％，主要表现为房间隔缺损、室间隔缺损、肺动脉发育不全、主动脉狭窄。但是由于这些改变大多需要心导管检查才能诊断，发现比较困难，因此长期以来未受到人们重视。我们在斑马鱼FAS模型中，观察到乙醇对斑马鱼心血管系统的发育有很强的干扰作用。实验中，用不同浓度的乙醇处理斑马鱼胚胎，发现能够干扰其胚胎循环系统的建立，半数有效浓度(EC50)为182.5mM。乙醇短暂暴露实验显示圆顶期为敏感时间窗，400mM乙醇短暂暴露3h能够导致43％的胚胎产生循环障碍。我们排除了乙醇对斑马鱼造血系统影响，通过血管内皮细胞分子标记（Flk-1）进行原位杂交显示，乙醇干扰了躯干部体轴血管的建立，而对头面部血管没有影响。用动脉和静脉的分子标记（ephrinB2和ephB4）进行原位杂交以及半薄切片显示，乙醇主要干扰斑马鱼背主动脉的形成，而对体轴静脉没有明显影响。进一步研究表明，乙醇影响斑马鱼底索的发育，因缺少底索分泌的Radar和Ang-1等血管形成因子，间接地影响了背主动脉的形成和稳定。这些结果为研究乙醇对人类心血管系统发育的影响提供了线索。2．斑马鱼早期胚胎蛋白质组学分析采用二维凝胶电泳分离斑马鱼受精卵期、圆顶期、胚盾期和5体节期的胚胎总蛋白。银染后，通过凝胶扫描仪获取凝胶图像，并用Image Master 2D软件分析。检测出受精卵期间蛋白点226个，圆顶期蛋白点307个，胚盾期蛋白点327个，5体节期蛋白点574个。显示受精卵期至胚盾期蛋白数量有少量增加，至5体节期蛋白数量急剧增加，表明蛋白表达数量与形态学的变化和器官发生有密切关系。48％的早期蛋白点在5体节期蛋白图谱中仍然存在，提示母体蛋白质对斑马鱼胚胎的发育起着重要的作用。选取4个不同发育阶段共有的3个高丰度蛋白点进行质谱鉴定，结果为卵黄蛋白的三种不同剪切形式，表明斑马鱼早期胚胎样品中卵黄生成素丰度较高。本文对斑马鱼胚胎蛋白质组学的相关技术进行了改进，建立了斑马鱼早期胚胎发育的二维电泳图谱，为进一步开展斑马鱼功能蛋白质组学的研究提供重要平台。进一步利用二维电泳分离正常对照组及乙醇处理组胚胎总蛋白。ImageMaster 2D Elite软件对正常和乙醇处理胚胎二维电泳进行差异分析，发现表达下调的蛋白点3个，表达上调的蛋白点7个。质谱鉴定结果表明这三个下调蛋白点分别为前脑菲肽原、TAR DNA结合蛋白和胶原蛋白2al。这为进一步研究乙醇致畸作用的分子机制提供重要线索。3．乙醇干扰斑马鱼Nodal信号通路我们证明了乙醇导致的体轴发育障碍是由于乙醇干扰了轴中胚层的发育，而独眼畸形是由于乙醇干扰了前脊索板（prechordal plate）迁移引起的。通过原位杂交证实了二维电泳的结果，发现乙醇干扰了轴中胚层的细胞外基质——Col2al的表达。我们还发现乙醇能够影响斑马鱼胚胎左右轴分化，并且认为这种改变是由于乙醇干扰了Nodal信号通路导致的。为了证明这一假设，将外源性Nodal信号分子注射入斑马鱼胚胎，诱导其下游基因gsc和ntl的表达。通过检测乙醇暴露后gsc和ntl的表达水平变化，证明了乙醇作用于Nodal信号通路干扰斑马鱼胚胎的发育。文献报道，乙醇处理胚胎能够使其shh基因表达下调，但究竟乙醇是否直接干扰shh信号通路目前还没有定论。我们将外源性的shh信号分子注射入斑马鱼胚胎，诱导其下游基因foxA2和nkx2.2a的表达。通过检测乙醇暴露后foxA2和nkx2.2a的表达水平变化，证明了乙醇对shh信号通路没有直接的干扰作用。Nodal的长程效应对维持胚胎内Nodal浓度梯度起着重要的作用，sqt主要参与Nodal长程旁分泌，而cyc则参与Nodal短程旁分泌。我们发现乙醇对不同Nodal信号分子的干扰作用是不同的，将sqt和cyc mRNA注射入128细胞期胚胎动物极的单个细胞内，然后用乙醇处理，结果表明乙醇主要干扰了sqt的作用范围，而对cyc的作用范围没有影响。由于乙醇干扰了斑马鱼胚胎的Nodal长程旁分泌，从而使斑马鱼原肠胚期的Nodal信号浓度梯度不能很好的建立，从而影响了轴中胚层以及附属器官的发育。

论文目录

• 英文缩略词表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一部分 乙醇干扰斑马鱼心血管系统的发育
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第二部分 斑马鱼早期胚胎蛋白质组学分析
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 第三部分 乙醇干扰斑马鱼NODAL信号通路
• 1 材料和方法
• 2 结果
• 3 讨论
• 全文总结和展望
• 全文参考文献（REFERENCE）
• 综述
• 参考文献
• 致谢
• 发表论文与获奖情况