Livin特异性siRNA表达载体在胃癌细胞中的稳定表达及意义

论文摘要

目的:胃癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,大多数患者发现时已处于晚期,手术难以根治,以化疗为主的综合治疗是晚期胃癌的主要治疗手段,但疗效尚不能令人满意。随着基础医学研究的不断进展,人们认识到胃癌对多种药物产生耐受是治疗失败的主要原因,而胃癌细胞对凋亡的抵抗是胃癌耐药性获得的一个重要因素。所以,研究凋亡抵抗发生的机制以及诱导肿瘤细胞凋亡成为目前研究的热点之一。Livin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein family,IAP）家族的新成员,因其在凋亡中可能发挥的重要作用而日益受到重视。目前研究提示Livin可能与肿瘤发生、发展和恶性程度相关,但Livin在人胃癌细胞中的表达情况及其导致的结果的研究尚不够深入,值得进一步研究。本研究旨在:（1）通过检测Livin基因在正常胃腺细胞和多种胃癌细胞系中的表达,探讨Livin在正常胃组织和胃癌细胞中的表达情况;（2）设计靶向沉默Livin的真核表达载体,并转染至人的胃癌细胞系,检测转染后对该细胞Livin的核酸水平和蛋白水平的抑制情况,从而筛选有效沉默Livin表达的胃癌细胞系;（3）对构建好的稳定沉默Livin的人胃癌细胞系,检测其细胞增殖能力及对凋亡刺激的敏感性,探讨Livin在细胞增殖和凋亡抵抗中可能发挥的作用。方法:（1）采用逆转录多聚酶链式反应（RT-PCR）法检测正常胃腺细胞和三株人胃癌细胞（SGC-7901、AGS、BGC）中的Livin的mRNA的表达;（2）用Western blot法检测上述各细胞系中Livin蛋白的表达;（3）设计靶向沉默Livin的真核表达载体,脂质体法转染SGC-7901细胞,半定量RT-PCR和Western blot检测Livin基因在SGC-7901细胞中的沉默情况,G418筛选获得稳定转染的细胞克隆;（4）流式细胞仪检测转染前后胃癌细胞SGC-7901对凋亡刺激剂敏感性的改变,MTT法检测5-Fu、顺铂等对转染前后细胞的半数抑制浓度（IC50）的改变及转染前后细胞增殖能力的差异。结果:（1）正常胃组织中未检测到Livin基因的表达,而在三株胃癌细胞株中均能检测到Livin的表达,Livin的两种异构体同时表达;在Livin mRNA阳性的胃癌细胞系中,均能检测到相应的蛋白表达,且蛋白的表达水平与mRNA表达水平基本一致;（2）设计沉默Livin的4个siRNA序列及一个阴性对照siRNA序列;在pGPU6/GFP/Neo载体两端分别引入BbsI和BamHI酶切位点,将载体经双酶切（BamHI/BbsI）后回收获得线性化空载体,通过T4DNA连接酶将shRNA模板克隆至线性化的pGPU6/GFP/Neo载体,并进行转化、筛选及酶切鉴定,酶切分析正确的克隆行测序确认。从而获得了四条沉默Livin的siRNA真核表达载体,脂质体转染后其中一条siRNA能够较显著地抑制胃癌细胞Livin mRNA和蛋白的表达,与阴性对照组相比较,RT-PCR法检测示Livin mRNA沉默效率大于70%,Western blot法检测示Livin蛋白表达显著下降（P＜0.01）;（3）将显著沉默Livin基因的质粒进行抽提,并转染胃癌细胞,经500μg/ml G418行耐新霉素筛选,形成稳定克隆,进行扩增和传代培养;（4）沉默Livin表达后,胃癌细胞增殖能力显著低于对照组（P＜0.05）,且对5-Fu和顺铂等药物的敏感性增加,IC50显著降低（P＜0.01）;（5）Livin沉默的胃癌细胞凋亡率显著高于对照组（P＜0.05）,经5-Fu和顺铂作用后其凋亡率有进一步增加（P＜0.01）。结论:（1）Livin在三株胃癌细胞系中表达,而在正常胃组织中不表达,提示其表达与胃癌的发生发展可能有关;（2）体外转染靶向沉默Livin的siRNA能够抑制胃癌SGC-7901细胞中Livin的表达;（3）Livin沉默的胃癌细胞增殖能力减弱,自发凋亡增加,且对化疗药物的敏感性增强。livin有可能成为肿瘤凋亡诱导治疗的新靶点。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一部分 Livin基因在正常胃细胞和胃癌细胞株中的表达
• 1 材料、方法与结果
• 2 半定量RT-PCR分析
• 第二部分 Livin特异性siRNA表达载体的构建和稳定表达
• 1 材料、方法与结果
• 第三部分 Livin在胃癌细胞中的表达状况对其生物学行为的影响
• 1 材料、方法和结果
• 分析与讨论
• 小结
• 参考文献
• 附图
• 致谢
• 综述 Livin在肿瘤中表达的临床意义
• 参考文献