脂质体包裹质粒直接打点注射睾丸和卵巢生产转基因小鼠的研究

论文摘要

将外源基因整合进动物的生殖细胞中,能产生携带外源基因的转基因后代。本试验采用加强型绿色荧光蛋白作为标记,探索出通过将质粒（pIRES-eGFP）包裹脂质体（lipofection 2000）后注射到雌雄昆明白小鼠的生殖器官,转染不同时期的雌雄生殖细胞,进而生产转基因后代的方法。试验将含绿色荧光蛋白基因的加强型荧光蛋白质粒（pIRES-eGFP）5.2kbcDNA完整序列按常规方法提取、纯化、酶切鉴定后,用于转基因小鼠的研究。试验研究了雄性个体采用单侧、双侧打点注射睾丸对生殖能力的影响。结果表明:打点注射单侧睾丸和双侧睾丸对雄性小鼠的生殖能力具有相同的影响。试验对公鼠手术后的利用时间进行了研究。手术后,对公鼠的睾丸组织进行外源基因的PCR阳性检测,5d后检测结果呈阴性;对公鼠精液进行外源基因PCR检测,5d后精子阳性率呈下降趋势,而五周后阳性率回升,说明外源基因质粒进入睾丸后,一部分整合到了精子的基因组中,未被整合的部分可能逐渐被降解。精原干细胞分化成精子的周期约是5周,因此可以推测,手术后整合了外源基因的那部分精原干细胞在这个时候分化成携带外源基因的精子。由上述结果可以得到结论为:转染公鼠最佳的利用时间为术后1～40天这个阶段。试验对母鼠手术后的利用时间的研究表明,母鼠进行卵巢打点注射后,进入卵巢中的质粒由于代谢呈递减趋势,7d后不宜继续使用。将进行睾丸注射的公鼠与正常母鼠交配所得的后代称为A组,将进行卵巢注射的母鼠与正常公鼠交配所得的后代称为B组,公鼠的睾丸与母鼠的卵巢均进行手术后,交配所得后代称为C组。三组所得的后代小鼠均为活体。比较三个试验组小鼠的后代基因组PCR阳性率,得到结果如下:A组F1代小鼠尾尖组织经PCR检测阳性率为40.51%（32/79）。B组F1代小鼠经尾尖组织PCR检测阳性率为48.94%（46/94）。C组尾尖基因组PCR检测阳性率为81.36%（48/59）,Southern Blot阳性率为71.18%（42/59）。A、B、C三组仔鼠的阳性率中C组转基因阳性率与A、B两组相比提高32～40个百分点。结果表明:脂质体包裹外源基因直接打点注射睾丸和卵巢的方法,可将外源基因导入精子和卵母细胞中,继而通过配种获得转基因动物;同时转染精子和卵母细胞比单独转染一种生殖细胞得到的后代阳性率高。随机抽取C组仔鼠5只,组织解剖后分别提取肺、肝脏、睾丸、卵巢、心脏、肾脏和尾尖共7种组织的总RNA进行RT-PCR检测,结果发现:5只小鼠心脏、肝脏中都没有外源DNA存在,而其他组织中都存在,而且各种组织的外源DNA存在的拷贝数不等,造成阳性信号的强弱程度不同。将打点注射后的母鼠进行超排,超排后12h手术取卵母细胞,将卵母细胞置于荧光显微镜下观察,可见卵母细胞发绿色荧光,证实外源基因eGFP在卵母细胞中得到表达。手术后母鼠与正常公鼠交配,手术取出2-细胞期胚胎,置于荧光显微镜下观察,可见胚胎发绿色荧光。证实此方法处理母鼠,可得到能表达eGFP的转基因胚胎。将2～3日龄的各组仔鼠置于荧光活体成像仪中观察,用2～3日龄同性别的正常仔鼠作对照,观察结果是转基因鼠的四肢、颈部皮肤及腹部均可见荧光。说明绿色荧光蛋白基因在F1代鼠中得以表达,但是个体间表达的部位与荧光的强弱存在差异。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 转基因动物研究进展
• 1.1.1 显微注射法
• 1.1.2 逆转录病毒法
• 1.1.3 胚胎干细胞法
• 1.1.4 体细胞、胚胎细胞克隆法
• 1.1.5 精子介导法
• 1.1.6 原始生殖细胞介导法
• 1.2 精子介导法转基因动物研究进展
• 1.2.1 精子对外源DNA内化转运、整合、降解的分子机制
• 1.2.2 精子介导的转基因动物的方法
• 1.3 卵母细胞介导的转基因研究进展
• 1.3.1 卵母细胞发育
• 1.3.2 卵母细胞介导的转基因研究进展
• 1.4 脂质体的作用
• 1.5 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验对象
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 主要试剂及配制
• 2.1.4 手术器械
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 试验鼠的准备
• 2.2.2 提取RNA器皿的处理
• 2.2.3 超排方法
• 2.2.4 质粒的转化
• 2.3.5 质粒提取
• 2.3.6 质粒的质量和浓度的检测
• 2.3.7 探针的标记
• 2.3.8 打点注射法转染公鼠睾丸对公鼠繁殖力的影响
• 2.3.9 公鼠睾丸打点注射后外源DNA在睾丸组织中代谢时间的研究
• 2.3.10 母鼠卵巢打点注射后外源DNA在卵巢组织中代谢时间的研究
• 2.3.11 转基因母鼠与正常母鼠繁殖力的比较
• 2.3.12 母鼠卵巢打点注射后胚胎eGFP表达的检测
• 2.3.13 F1代转基因阳性小鼠的筛选和鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 质粒的酶切鉴定
• 3.2 PCR产物的电泳结果
• 3.3 打点注射法对公鼠生殖力的影响程度
• 3.4 外源DNA在睾丸组织和精液中的代谢时间
• 3.5 母鼠卵巢打点注射后外源DNA在卵巢组织中代谢的时间
• 3.6 转基因母鼠与正常母鼠繁殖力的比较结果
• 3.7 母鼠卵巢打点注射后卵母细胞的EGFP表达
• 3.8 母鼠卵巢打点注射后胚胎的EGFP表达
• 3.9 F1代小鼠基因组PCR产物的电泳结果及数据统计
• 3.10 PCR产物的SOUTHERN杂交结果
• 3.11 反转录PCR（RT-PCR）结果
• 3.12 PCR产物的序列测定
• 3.13 活体成像仪中观察F1代阳性鼠
• 4 讨论
• 4.1 小鼠麻醉及手术问题
• 4.2 台盼兰的指示作用
• 4.3 外源基因进入组织后的命运
• 4.4 雄性生殖细胞的转染
• 4.4.1 转基因阳性后代的筛选
• 4.4.2 转基因表达的检测
• 5 结论
• 6.参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况