孕酮、干扰素-τ对牛子宫内膜细胞基质金属蛋白酶-2及其抑制剂-2表达的影响

论文摘要

以处于黄体期的黄牛子宫为材料，用组织块法和胰蛋白酶消化法在体外培养子宫内膜原代细胞，对这两种方法进行比较，并将细胞传代，采用实时荧光定量PCR研究了孕酮（Progesterone，P）和干扰素-τ（Interferon-τ，IFN-τ）对黄牛子宫内膜细胞中基质金属蛋白酶-2（MMP-2）及其组织抑制剂-2（TIMP-2）mRNA表达的影响。结果如下：采用组织块培养法和胰蛋白酶消化法对子宫内膜细胞进行体外培养，均能培养出子宫内膜的混合细胞，组织块培养法培养的成功率（72.7％）高于胰蛋白酶消化法（33.3％）。传代后，两种方法培养出的细胞生长方式及形态特点无明显差异，都以间质细胞为主，可为进一步研究胚胎附植提供实验模型。孕酮和干扰素-τ对黄牛子宫内膜细胞MMP-2和TIMP-2 mRNA的表达有调节作用。孕酮（200nM）对MMP-2mRNA的表达具有促进作用，对TIMP-2 mRNA的表达具有抑制作用；干扰素-τ（100ng／ml）对MMP-2mRNA的表达具有促进作用，对TIMP-2的表达有明显的抑制作用（P＞0.05）；同时添加孕酮和干扰素-τ对MMP-2mRAN的表达的抑制作用，与对照组相比差异不显著（P＞0.05），对TIMP-2mRAN的表达有明显的抑制作用。孕酮处理组对MMP-2 mRNA的表达的促进作用比干扰素-τ处理组明显，同时添加孕酮和干扰素-τ对MMP-2 mRNA的表达有抑制作用；孕酮处理组、干扰素-τ处理组和同时添加孕酮和干扰素-τ的处理组对TIMP-2mRNA的表达都有抑制作用，但三个处理间组差异不显著。比较不同的激素及其培养不同的时间的处理组发现，添加孕酮培养24h时MMP-2mRNA表达量最高；同时添加孕酮和干扰素-τ培养6h时TIMP-2mRNA表达量最低。MMP-2mRNA相对表达量与添加孕酮培养的时间存在极显著正相关（R2＝0.914，P＜0.01）；与添加干扰素-τ培养的时间和同时添加孕酮、干扰素-τ共培养的时间有一定的正相关性，差异显著（P＜0.05）。TIMP-2mRNA相对表达量与添加孕酮培养的时间、干扰素-τ培养的时间，以及同时添加孕酮、干扰素-τ共培养的时间存在极显著正相关（R2＝0.901，P＜0.01）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 文献综述
• 1.1 基质金属蛋白酶及其抑制剂与胚胎植入的关系
• 1.1.1 MMPs和TIMPs简介
• 1.1.2 MMPs及TIMPs在子宫内膜中的分布、周期性变化
• 1.1.3 MMPs在子宫内膜中的调节
• 1.1.4 MMPs及TIMPs在胚胎植入中的作用
• 1.2 干扰素-T在妊娠识别中的作用
• 1.3 荧光定量PCR技术
• 1.3.1 荧光定量PCR定量原理
• 1.3.2 SYBR Green Ⅰ荧光染料
• 1.3.3 荧光定量PCR技术的应用
• 1.4 本研究的目的与意义
• 2 试验材料与方法
• 2.1 试验材料
• 2.1.1 组织样本采集
• 2.1.2 主要仪器设备
• 2.1.3 试验试剂
• 2.2 试验方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 试验设计
• 2.2.3 实时荧光定量PCR
• 2.2.4 统计分析结果
• 3 结果与分析
• 3.1 细胞培养
• 3.1.1 原代培养
• 3.1.2 传代培养
• 3.2 子宫内膜细胞生长曲线
• 3.3 细胞总RNA提取结果
• 3.4 常规PCR反应的结果
• 3.5 荧光定量PCR扩增的标准曲线
• 3.6 扩增产物的特异性
• 3.7 不同处理组目的基因MRNA表达的定量
• 3.7.1 激素与时间水平对MMP-2表达的影响
• 3.7.2 添加激素培养时间与MMP-2mRNA表达量关系的相关分析
• 3.7.3 激素与时间水平对TIMP-2表达的影响
• 3.7.4 添加激素培养时间与TlMP-2mRNA表达量关系的相关分析
• 4 讨论
• 4.1 细胞培养
• 4.1.1 细胞培养作为体外实验模型的缘由
• 4.1.2 培养方法的选择
• 4.1.3 关于是否分离腺上皮与间质细胞
• 4.2 避免基因组DNA污染
• 4.3 内参基因的选择
• 4.4 各种实时荧光定量PCR方法的比较
• 4.5 激素处理子宫内膜细胞对MMP-2和TIMP-2MRNA表达的影响
• 4.5.1 孕酮处理子宫内膜细胞对MMP-2和TIMP-2mRNA表达的影响
• 4.5.2 干扰素-τ处理子宫内膜细胞对MMP-2和TlMP-2mRNA表达的影响
• 4.5.3 孕酮和干扰素-τ联合处理子宫内膜细胞对MMP-2和TIMP-2mRNA表达的影响
• 5 结论
• 6 参考文献
• 致谢
• 附录
• 攻读学位期间发表论文情况