谢镇国王志坚
（福建医大附属第二医院福建泉州352000）
（福州神经精神病防治院福建福州350000）
【关键词】毛冬青甲素；caspase-3；心肌缺血再灌注；早期治疗
【中图分类号】R542.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752（2016）13-0150-02
心肌梗死病情进展迅速,能否及早准确判定疾病发展趋势,对能否及时有效的治疗至关重要。近年来的研究表明,其中主要的发病机制之一是细胞凋亡[1]。细胞凋亡是由基因控制的细胞主动死亡过程，caspase-3作为细胞凋亡的指标在其心肌缺血细胞凋亡过程起重要作用。毛冬青甲素（IlexoninA）是由活血化瘀中药毛冬青提纯的18-去氢乌索酸经琥珀酰化所得的五环三萜类化合物，近些年的研究表明其具有抗炎、抗血栓形成、改善血液循环等广泛的药理作用[2]。这给治疗提供了治疗的时间窗，因此抗凋亡是治疗心肌缺血的新靶点。本研究的目的是通过中药提取物毛冬青甲素干预对大鼠心肌缺血2h后再灌注急性损损伤的影响。
1.材料与方法
1.1实验动物及分组
选择成年健康雄性SD大鼠45只，体重250～280g。由上海市西普尔-必凯实验动物中心有限公司提供，许可证号：SCXK（沪）2008-0016。从45只大鼠中随机选出30只分为假手术组、模型组、毛冬青甲素治疗组（简称治疗组）3组，每组各10只。
1.2主要试剂
毛冬青甲素购自广东省博罗先锋药业，规格20mg／2mL，产品批准文号：国药准字Z44023366，产品批号：090101；氯化2.3.5-三苯四氮唑（TTC）(2，3，5一TriphenyltetrazoliumChloride,TTC)，美国Sigma公司，用双蒸水配成2%浓度；水合氯醛，北京鼎国生物公司产品，用双蒸水配成10%浓度。
1.3方法
血清hS-CRPcaspase-3采用化学发光免疫法,心肌缺血2h后腹主动脉取血检测。
1.4动物模型制作
模型组用10％的水合氯醛（360mg?kg-1）腹腔注射麻醉后，连接并持续记录标准肢体II导联，对大鼠行气管插管并连接呼吸机行辅助呼吸。采用李仪奎[3]方法，左胸常规消毒后，于左第3～4肋间开胸，剪开心包膜，挤出心脏，在左心耳和肺动脉圆锥之间距左冠状动脉根部2～3mm处，用6-0手术线结扎冠脉左前降支（假手术组仅穿线不结扎），在结扎线两端分别套入丝线环作为再灌注拉线，收紧结扎线（结扎时只打一个单结，以便再灌注时松开此结）造成心肌缺血，牵拉再灌注拉线使结扎放松，即再灌注（缺血30min，再灌注120min）。心肌缺血的判断标准为心电图出现心肌梗死的表现及以结扎部位以下心肌变白，搏动减弱作为造模成功标志，再灌注之后迅速将心脏送回胸腔，闭胸。
1.5药物治疗治疗组用毛冬青甲素注射液腹腔给药，取最佳剂量40mg/kg[4]，连续7d,每天1次，末次给药1h后进行造模手术。假手术组和模型组注射等量生理盐水,连续7d,每天1次,末次注射生理盐水1h后进行造模手术。
1.6TTC标本取材及染色
假手术组和模型组和药物治疗三组大鼠在缺血再灌注后2h，腹主动脉取血后取材，剖取心脏，用冰生理盐水洗净残血，滤纸吸干，称重，去除心房及脂肪组织，将左心室横切成1～2mm厚的薄片，置于2%TTC溶液，37℃避光孵育30min。梗死区为白色，正常心脏组织被染成玫瑰红色。至梗死区界限清晰时取出，分离心肌梗死区，以称重法分别计算其重量,用滤纸吸干，称质量，计算心肌梗死率，心肌梗死范围大小以心肌梗死率来表示。
心肌梗死率=心肌梗死区质量(g)/全心质量(g)×100%.
1.7统计学处理
所获数据均为正态分布，采用x-±s表示，SPSS18.0统计软件进行单因素方差分析和t检验。
2.结果
2.1大鼠心肌梗死率((x-±s，n均=10)
注：与模型组相比；1﹚P<0.01，2﹚P<0.05。
3.讨论
心肌缺血一定时间后可引起心肌细胞损伤,早期再灌注虽可挽救部分濒临死亡的细胞,但再灌注本身也可加重心肌损害。其中以心肌细胞的凋亡为其主要的发病机制之一。Caspase家族是细胞凋亡过程中重要的蛋白酶；Caspase-3是半胱天冬酶家族成员之一，参加细胞凋亡信号，它是各种细胞凋亡蛋白酶级联反应的必经之路，是凋亡的关键酶和执行者，故又称之为“死亡蛋白”[5]；在各种程序启动的凋亡程序中起最后枢纽的作用，促使细胞凋亡。有学者认为,Caspase-3是心肌缺血预后的一个较有价值的指标，可以独立预测心肌梗死的死亡率及其心脑血管病变的发生率[6]。陈洁文等人[7］在毛冬青甲素对脑细胞缺氧损伤的保护作用研究中，观察到毛冬青甲素主要是通过有效的减弱谷氨酸对脑片诱发电位的抑制效应，从而对抗谷氨酸对神经细胞的毒性作用。
本实验结果显示，毛冬青甲素预处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用，同时主要从其抑制凋亡的方面探讨其保护机制。与假手术组对比，及后Caspase-3的表达水平明显升高；与模型组对比，干预组的Caspase-3的表达水平减低。因此，对Caspase-3进行早期干预，有可能降低细胞凋亡，进而减轻缺血性损伤。证实了毛冬青甲素可以抑制心肌缺血再灌注损伤后的细胞凋亡，减小梗死范围。其对缺血性梗死保护作用可能与抑制caspase-3的表达有关。本研究为应用毛冬青甲素抗心肌缺血死再灌注后细胞凋亡提供了依据，为心血管病病情的早期诊断提供有意义的参考指标。
【参考文献】
[1]AbasF，AlkanT，GorenB，etal.Neuroprotectiveeffectsofpostconditioningonlipidperoxidationandapoptosisafterfocalcerebralischemia/reperfusioninjuryinrats［J］．TurkNeurosrg，2010，20(1):1-8．
[2]华海婴，李艳瑛.毛冬青甲素药理作用的研究［J］.中国现代医药杂志，2006，8（11）：137-138.
[3]李仪奎.中药药理实验方法学[M].2版.上海：上海科学技术出版社，2006：320.
[4]石旺清，郑关毅.毛冬青甲素对大鼠脑缺血再灌注后GAP-43表达的影响［J］.福建中医药，2010，41（2）：46-47.
[5]BroughtonBR，ReutensDC，SobeyCG．Apoptoticmechanismsaftercerebralischemia［J］．Stroke，2009，40(5):331-339．
[6]TORZEWSKIJ,TORZEWSKIM,BOWYERDE,eta1.C-reactiveproteinrequentlycolocatizeswiththeterminalcomplementcomplexintheintimaofearlyatheroscleroticlesionsofhumancoronaryarteries.ArteriosclerThrombVaseBiol,1998,18:1389-1392.
[7]陈洁文谭宝璇苏文.毛冬青甲素对脑细胞缺氧损伤的保护及其机制的实验研究[J].广州中医药大学学报199714（2）：97.