甘蓝型油菜磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ihpRNA种子特异性表达载体构建及遗传转化

论文摘要

油菜是世界范围内广泛种植的油料作物，是世界食用植物油和植物蛋白的重要来源，在国际农产品贸易中占有重要的地位。植物油是栽培油菜的主要农产品，它不仅是人和动物必须脂肪酸的主要来源，也是油漆、润滑剂、化妆品、尼龙等化工产品的重要原料。我国的油菜种植面积(主要在长江流域)超过一亿亩，占世界种植面积的1／3，为我国人民提供了60％以上的食用油。然而与加拿大等国家相比，我国多数油菜品种的含油量偏低：国际油菜籽的平均含油量大约42％，我国油菜籽的平均含油量仅为35％。因此，高含油量油菜品质育种具有十分重要的现实意义。磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)与油菜含油量有着密切的关系。其间接控制了油脂、蛋白质生物合成的共同底物磷酸烯醇式丙酮酸的流向，从而决定植物种子蛋白质／油脂含量比例。我们利用RNAi技术抑制PEPC，使可溶性糖更加充分地流入种子中的脂肪代谢途径，以望获得高含油量的转基因油菜。本研究作了以下工作并取得相关结果：1、本研究从油菜中分别克隆出了napin基因启动子(种子特异性启动子)及pepc基因片段，与已报道的序列的同源性分别达到了100％和93％，并以此构建了油菜种子特异表达的pepc基因ihpRNA载体，经质粒PCR及酶切检测证实该载体构建成功。通过冻融法将表达载体转化到农杆菌LBA4404，并经菌落PCR得到验证。pepc正反义链序列已分别登录到GenBank，序列号为EF53920和EF565860。2、将携带表达载体的农杆菌LBA4404浸染湘油15号子叶节外植体。通过对甘蓝型油菜子叶节遗传转化体系进行优化，从而建立了高效的农杆菌介导的遗传转化系统，并获得了抗卡那霉素的油菜转基因苗。经PCR检测，napin启动子和pepc基因都整合到了湘油15号基因组中，这为以后培育出高含油量油菜打下了一个很好的基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 第一节 油菜含油量研究进展
• 1 油菜含油量的调控
• 2 基因工程技术在油菜含油量上的应用
• 第二节 RNAi技术的原理以及在植物功能基因组中的应用
• 1 RNAi技术的原理
• 2 RNAi在植物基因工程中的应用
• 第三节 本研究的目的与意义
• 第二章 甘蓝型油菜napin基因启动子的克隆及测序
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 napin基因启动子的克隆
• 1.2.2 重组克隆测序及序列同源性比较
• 2 结果
• 2.1 油菜种子特异表达napin基因启动子的克隆及酶切检测
• 2.2 测序及同源性分析
• 3 讨论
• 第三章 甘蓝型油菜pepc基因片段的克隆及种子特异表达的ihpRNA载体建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 pepc基因正反义链片段的克隆及序列分析
• 1.2.2 油菜pepc3内含子的克隆及序列分析
• 1.2.3 种子特异表达的pepc基因ihpRNA载体构建
• 1.2.4 pepc基因ihpRNA表达载体转化根癌农杆菌LBA4404
• 2 结果
• 2.1 pepc基因片段的克隆及序列分析
• 2.2 油菜pepc3内含子的克隆序列分析
• 2.3 种子特异表达的pepc基因ihpRNA载体构建
• 2.4 根癌农杆菌的转化
• 3 讨论
• 3.1 pepc基因的特性及其基因片段的克隆
• 3.2 PEPC功能及其基因工程
• 第四章 甘蓝型油菜的遗传转化及转基因油菜的获得
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 油菜无菌苗的获得
• 1.2.2 油菜外植体的获得
• 1.2.3 农杆菌介导的油菜子叶柄遗传转化体系的建立
• 1.2.4 转基因油菜的PCR检测
• 2 结果
• 2.1 卡那霉素临界值的确定
• 2.2 农杆菌介导的油菜子叶柄遗传转化体系的优化
• 2.2.1 预培养时间对子叶柄遗传转化的影响
• 2.2.2 共培养时间子叶柄遗传转化的影响
• 2.2.3 抗性植株的获得
• 2.2.4 转基因油菜的PCR检测
• 3 讨论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历