苹果茎沟病毒cp基因hpRNA表达载体的构建及其转化烟草研究

论文摘要

病原获得抗性是植物抗病毒基因工程的一个重要策略,即将病毒自身的基因导入植物后,可使该植物对同种及亲缘关系较近的病毒产生抗性,在该策略中应用最早的基因是来自病毒的外壳蛋白基因。大量的研究表明,导入植物的基因转录物可与入侵的病毒RNA之间相互作用,干扰病毒的侵染或复制,这种抗性主要是基于转录后基因沉默（post-transcriptional gene silencing,PTGS）作用。苹果茎沟病毒（Apple stem grooving virus,ASGV）在苹果和梨树上发生极其普遍的一种+ssRNA病毒,在果树上多表现为潜伏侵染,但可导致树势的降低和影响果品质量。同时,该病毒可通过汁液摩擦接种传染至多种草本植物,接种草本寄主植物是研究该病毒生物学特性的常用途径之一。本研究基于dsRNA在RNA沉默中的诱导作用,构建ASGV外壳蛋白基因片段的转录后可形成发夹状RNA（hpRNA）的载体,通过农杆菌介导转化该病毒的草本寄主植物本氏烟,以期为进一步研究hpRNA诱导对同源病毒和异源病毒的抗性及其RNAi特性奠定基础。（1）根据ASGV的CP基因序列特点,设计合成了可扩增该基因近3’端和5’端大小分别为209bp和392bp的两对引物,并在各引物5’端引入两个酶切位点。以本实验室保存的一个ASGV分离物CP基因克隆的质粒为模板,用所合成两对引物分别扩增获得长度为392bp和209bp的特异片段。通过回收、连接、转化E.coli DH10B和酶切鉴定,对所获扩增片段进行了克隆。（2）采用所设计酶切位点对应的两对限制性内切酶对含有392bp克隆片段的质粒分别进行双酶切,回收目标片段后与相同双酶切的表达载体pASDS714进行连接和转化大肠杆菌,获得含有392bp片段的正向和反向插入片段的重组质粒pASDS714-392（+）和pASDS714-392（-）然后对获得的pASDS714-392（+）采用另一对酶进行双酶切后与同对酶双酶切获得的392bp片段连接,获得在内含子两端分别含有正向插入和反向插入片段的可表达hpRNA的重组质粒pASDS714-392（hp）。（3）采用同样的方法,构建了ASGV CP基因3’端大小为209bp片段的正向插入和反向插入的重组质粒pASDS714-209（+）和pASDS714-209（-）。（4）将以上所获含392bp反向插入片段和可表达392bp片段的hpRNA的重组质粒分别转化根癌农杆菌EHA105后,采用农杆菌侵染法转化本氏烟（Nicotianabenthamiana）叶盘,经共培养和抗性筛选,获得pASDS714-392（-）和pASDS714-392（hp）转化的抗性芽系各24和32株。采用CTAB法从获得的各抗性芽系的离体培养植株提取总DNA,利用扩增该片段的特异引物对其6个和13个芽系进行PCR鉴定,前者有3株检测为阳性,后者13株检测结果均为阳性。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1 苹果茎沟病毒（ASGV）的研究概况
• 1.1 ASGV的生物学特性
• 1.1.1 寄主范围
• 1.1.2 症状
• 1.1.3 传播途径
• 1.2 ASGV病毒特性及基因组结构特征
• 1.2.1 病毒特性
• 1.2.2 ASGV的基因组结构特征
• 1.3 植物抗病毒基因工程
• 1.3.1 培育和栽培无病毒苗木
• 1.3.2 抗病毒基因工程的研究进展
• 1.3.2.1 CP基因介导的抗病性研究
• 1.3.2.2 MP基因介导的抗性研究
• 1.3.2.3 复制酶基因介导的抗性研究
• 1.3.2.4 反义RNA技术
• 2 RNAi的研究概况
• 2.1 RNAi的发现
• 2.2 RNAi技术的机制
• 2.3 RNAi技术的特点
• 2.4 RNAi技术在植物基因工程中的应用
• 2.4.1 植物中RNAi诱导方法
• 2.4.2 RNAi在植物基因工程中的应用
• 3 目的及意义
• 第二章 苹果茎沟病毒CP基因hairpin RNA表达载体的构建
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 供试材料
• 2.1.1.1 材料来源
• 2.1.1.2 菌种、质粒、主要试剂
• 2.1.2 hpRNA植物表达载体的构建策略
• 2.1.3 目标短片段的获得
• 2.1.3.1 引物的设计
• 2.1.3.2 目标片段的PCR扩增
• 2.1.3.3 DNA片段的回收
• 2.1.3.4 目标片段与载体的连接
• 2.1.4 连接产物转化宿主菌
• 2.1.4.1 DH10B感受态细胞的制备
• 2.1.4.2 电击转化大肠杆菌DH10B感受态细胞
• 2.1.5 质粒DNA的提取
• 2.1.6 重组质粒的鉴定
• 2.1.6.1 PCR鉴定
• 2.1.6.2 酶切鉴定
• 2.1.7 克隆片段hpRNA表达载体的构建
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 片段5'seg392的hpRNAi植物表达载体的构建
• 2.2.1.1 目标片段5'seg392的PCR扩增
• 2.2.1.2 目标片段5'seg392的TA克隆质粒的鉴定
• 2.2.1.3 5'seg392正向与反向重组植物表达载体的获得与鉴定
• 2.2.1.4 5'seg392 hpRNA表达载体的获得与鉴定
• 2.2.2 3'seg209的正向和反向重组植物表达载体的构建
• 2.2.2.1 目标片段3'seg209的PCR扩增
• 2.2.2.2 目标片段3'seg209的TA克隆质粒的鉴定
• 2.2.2.3 3'seg209正向重组载体的获得与鉴定
• 2.2.2.4 3'seg209反向重组载体的获得与鉴定
• 第三章 苹果茎沟病毒CP基因目标片段的重组植物表达载体转化烟草研究
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 主要试剂和供试材料
• 3.1.2 研究方法
• 3.1.2.1 根癌农杆菌感受态细胞的制备
• 3.1.2.2 重组植物表达载体转化根癌农杆菌感受态细胞
• 3.1.2.3 烟草的转化、再生
• 3.1.2.4 Hyg抗性植株的筛选及PCR检测
• 3.2 结果和分析
• 3.2.1 重组载体转化烟草后叶盘的生长、分化情况
• 3.2.2 转基因烟草植株的获得
• 3.2.3 转基因烟草植株的PCR检测
• 3.3 结论与讨论
• 3.3.1 小结
• 3.3.2 讨论
• 附录 试验常用溶液配方
• 参考文献
• 致谢