人GDNF基因片断的克隆表达及其蛋白鉴定

论文摘要

胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF）是1993年Lin等首先在大鼠胶质细胞系B49培养液上清中发现的一种神经营养因子,具有特异地促进中脑多巴胺能神经元生长、分化,增强其对多巴胺摄取的生物学活性的作用。此外,GDNF还具有能促进体外培养的脊髓运动神经元存活的作用;周围神经损伤后局部给予GDNF具有抑制周围神经损伤诱导的运动神经元逆行性变性（retrograde degeneration）的作用,并且还能促进损伤后周围神经的再生。因GDNF具有特异地促进中脑多巴胺能神经元存活、分化和增强其对多巴胺摄取等生理作用,而成为近年治疗帕金森病的热门。在本研究中,从人胶质瘤组织中提取总RNA,采用RT-PCR的方法扩增出全长约为402bp的DNA片段,构建了携带GDNF基因的重组质粒,转化到原核蛋白表达系统。在IPTG的诱导下得到的GDNF蛋白,采用分子筛层析法对GDNF蛋白进行粗提;采用SDS-PAGE对表达的GDNF蛋白分子量及纯度进行分析;采用鸡胚背根神经节培养法测定所表达GDNF的生物学活性。本实验共分六部分,主要包括:①GDNF目的基因的获得;②表达载体的构建;③表达载体的鉴定;④目的蛋白的表达;⑤目的蛋白的粗提;⑥目的蛋白的鉴定。结果获得了402bp的基因片段,连入T载体后测序表明序列与基因库中完全一致。经SDS-PAGE分析证明重组质粒所表达的蛋白分子量在32K左右。目的蛋白粗提后有促进了鸡胚背根神经节突触的生长的作用。以上结果说明本研究采用的PET原核表达系统成功制备得到了具有生物活性的GDNF蛋白。

论文目录

内容提要

引言

1 GDNF 的分子生物学特性

2 GDNF 的分布

3 GDNF 的基因表达与调控

4 GDNF 的生物学活性

5 GDNF在帕金森病中的应用

6 GDNF 与神经肌肉疾病

7 GDNF 与免疫系统的关系

材料和方法

1 材料

1.1 标本

1.2 菌株与质粒

1.3 主要试剂

1.4 主要仪器

2 方法

2.1 样本制备

2.2 从组织中提取mRNA

2.3 引物设计

2.4 RT-PCR 反应

2.5 PCR 产物电泳

2.6 制备大肠杆菌JM109 感受态细胞

2.7 pET-28a（+）空质粒的扩增

2.8 试剂盒回收PCR 双酶切产物

2.9 原核表达载体pET-28a 双酶切产物与PCR 双酶切产物连接

2.10 原核表达重组质粒pET-28a-GDNF 转化

2.11 重组质粒的扩增及鉴定

2.12 酶切产物与PGEM-T 克隆载体连接

2.13 酶切产物与PGEM-T 克隆载体连接后的产物的转化、培养、质粒重提

2.14 取阳性重组质粒送上海生工测序分析

2.15 原核表达重组质粒pET-28a-GDNF 转化进入BL21 细胞

2.16 pET-28a-GDNF/BL21 的诱导表达

2.17 pET-28a-GDNF/BL21 的诱导表达产物的简单鉴定

2.18 目的蛋白的粗提

2.19 目的蛋白的生物学活性鉴定

结果

1 基因引物序列设计

2 目的DNA 片段PCR 产物琼脂糖凝胶电泳鉴定

3 重组质粒及 NheⅠ和 HindIII 酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图

4 连接目的基因的T4 重组质粒测序及分析结果

5 表达载体分泌蛋白的SDS-PAGE 电泳结果

6 目的蛋白的粗提

7 表达的蛋白对鸡胚背根神经节的影响

结论

讨论

参考文献

中文摘要

Abstract

致谢

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