论文摘要
研究背景中枢神经系统疾病、糖尿病及高血压等全身病变、青光眼等神经退行性病变、外伤、炎症等等均可引起视神经的损害,导致视功能的严重丧失,甚至法定盲。而视神经损害和视功能丧失的中心环节是视网膜节细胞的损害。视网膜节细胞的损伤分为两个步骤：原发性的损伤和继发性的凋亡。现有的视神经的保护治疗更多地针对原发性的损伤,如控制青光眼患者的眼内压、控制糖尿病性视神经视网膜病变患者的血糖水平及糖皮质激素抑制炎症反应。然而,越来越多的迹象表明即使眼内压控制得很理想、血糖也被降至标准范围,视神经的损伤及节细胞的凋亡仍继续加重,最终难以避免视功能的进一步丧失。目前针对视神经损伤机制的研究目前主要集中在建立RGC凋亡模型的基础上研究其凋亡的发生与发展。因此在理想的RGC凋亡模型的基础上,阻断继发性凋亡的研究成为急切需求,寻找分子水平的凋亡启动因子成为重点。目前针对视神经损伤机制研究建立的RGC凋亡模型大多参差不齐,分为定性或定量、部分横断或完全横断视神经、按病因分为机械性、高眼压性、缺血性、毒性或糖尿病性等等。由于视神经疾病种类多种多样,许多发病机制不明,故很难用一个统一的标准去评判各类实验研究结果。其中,视神经完全横断动物模型是将视神经自视交叉前任一部位切断,造成所有RGC轴突完全断离。这种模型优点是各实验动物致伤量一致,观察再生时不受残留未受损轴突的影响。而以往的横断模型是将视神经暴露后,单纯于球后离断之。这致使眼球及视网膜的供血受到严重影响,无法真实地进行节细胞凋亡的研究。我们的实验采用暴露视神经后,显微剪纵行剥开视神经外膜,在外膜内、球后2mm处离断视神经的方法,使得眼球及视网膜的血供不受影响,相对真实地建立了视神经横断模型。淀粉样蛋白（amyloid）是一种沉积于血管壁和结缔组织中透明均匀性物质。当组织内出现淀粉样蛋白沉着时,特别是浸润某些重要器官产生淀粉样蛋白过度沉积时,不但可以逐渐损伤并破坏正常组织功能,而且是一种进行性和预后不良的疾病。β-淀粉样蛋白（β-amyloid protein Aβ）是参与神经损伤及致细胞凋亡的非常重要的因子,它是β-淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein, APP）的一种降解产物。APP是广泛表达在多种组织和脑组织各部位神经元细胞膜表面的一种跨膜蛋白,多种细胞因子（IL-1、IL-4、NGF、TGF-β、bFGF等）和某些外源性刺激如热休克、创伤等均可影响APP基因的表达。APP是炎症反应、免疫反应、凝集反应及组织损伤,修复等生理过程中的重要物质。APP可被α、β、γ三种分泌酶降解。β和γ,分泌的降解产物为β-淀粉样蛋白,后者具有细胞毒性,可导致细胞凋亡。Alzheimer病（AD）是一种发病率最高、危害最大的中枢神经系统退变性疾病。Hardy J等的研究较早表明Ap沉积是AD发病的中心环节,减少Ap沉积或清除已形成的淀粉样蛋白斑块可以有效预防和治疗AD。作为重要的致神经退变因子,Ap与眼科的相关研究,特别是与视神经损伤的研究较少。我们假设其在视神经损伤中发挥了如同中枢神经系统一样重要的作用,并用实验证实Ap在视神经损伤模型中的表达及其机制。视网膜节细胞通常在受到损伤或退行性变后轴突不能再生,但最近10余年来的研究表明我们可以通过激活节细胞固有的生长状态、维持它们的生存能力及抵制外环境的抑制信号达到部分再生的状况[30]。主要为以下三个方面：1.阻止神经节细胞凋亡的继续发生。例如：谷氨酸受体拮抗剂；钙通道阻滞剂；一氧化氮（NO）与其合酶（NOS）抑制剂；基因调控凋亡；自由基清除剂和抗氧化剂；热休克蛋白；锌等。2.促进新的神经节细胞的再生。例如：补充外源性神经营养因子；视神经干细胞移植；雪旺细胞玻璃体腔移植等。3.修复已发生凋亡的神经节细胞。例如：补充外源性神经营养因子；视神经干细胞移植；雪旺细胞玻璃体腔移植以及各种中医药等。这些研究成果使得视神经的功能恢复成为可能,但是目前视神经保护药的种类和效果还相当有限。中医药在视神经保护方面有较大的优势,在积极探索视神经损伤的发病机理的同时,加快中医药在视神经保护方面的临床和基础研究,发挥中医药的优势,必将提高我国防盲治盲水平。乌鸡白凤丸有效成分（Bak Foong Pills, BFP）是一种广泛用于治疗妇科疾病的传统中药,并具有类雌激素样作用活性,如降低血压、增加血管舒张度、减少血清三酰甘油、抗血小板活性以及刺激脑内DA释放等多种药理作用。另外,谢俊霞等[54,55]研究表明BFP可以抑制海马神经元凋亡,具有神经保护作用。而BFP抗神经元凋亡作用在眼科鲜有报道。我们的实验以SD大鼠为研究对象,观察BFP干预处理对视神经损伤导致的视网膜神经节细胞的凋亡是否具有保护作用,并对其机制进行了初步探讨。目的本研究在建立大鼠视神经横断模型的基础上观察β-淀粉样蛋白在视神经病变时眼部的表达及其发生机制。并探讨了中药乌鸡白凤丸有效成分（BFP）对其表达的影响作用。方法1.改良大鼠视神经横断模型建立：健康SD大鼠54只,随机分为三组,分别为损伤组（model组）、假损伤对照组（sham组）、正常对照组（control组）。Model组24只大鼠,左眼为损伤眼,右眼为未损伤眼,作为对照,按损伤后存活时间不同分为3h组、48h组、7d组、14d组,每组6只,暴露视神经,使用显微剪纵行剥开视神经外膜,在外膜内、球后2 mm处离断视神经；Sham组24只大鼠,左眼为假损伤眼,右眼为未损伤眼,作为对照,按损伤后存活时间不同分为3h组、48h组、7d组、14d组,每组6只,仅暴露视神经但不进行离断损伤；6只为正常对照组。均于处死前7d采用双上丘注射5%荧光金（FG）标记双眼视网膜神经节细胞。取眼球标本并分离视神经至视交叉。视网膜铺片荧光照相,RGCs计数及RGCs标识率计算。并对视网膜切片进行苏木精-伊红染色,观察视神经损伤后视网膜形态学变化。2.β-淀粉样蛋白在视神经横断大鼠视网膜内的表达及机制：将81只健康成年S-D大鼠以第一部分相同的纳入标准入组。其中损伤组（model组）和假损伤对照组（sham组）,每组36只。均使用第一章中所述的步骤在model组大鼠建立视神经横断损伤模型,均损伤左眼。按损伤后存活时间不同分为3h组、48h组、7d组、14d组,每组9只,暴露视神经,使用显微剪纵行剥开视神经外膜,在外膜内、球后2 mm处离断视神经；Sham组36只大鼠,左眼为假损伤眼,右眼为未损伤眼,作为对照,按损伤后存活时间不同分为3h组、48h组、7d组、14d组,每组9只,仅暴露视神经但不进行离断损伤；9只作为正常对照组（control组）。分别于造模成功后3h、48h、7d、14d（每个时间段3只大鼠）处死动物。①采用Western-blotting技术检测model组、sham组及control组四个时间点的β-淀粉样蛋白的表达情况；②使用免疫组化技术观察model组、sham组及control组四个时间点的β-淀粉样蛋白的表达情况；③使用RT-PCR技术检测model组、sham组及control组四个时间点的Bcl-2 mRNA、Bax mRNA以及Caspase-3 mRNA的在视网膜内的表达水平；并以control组大鼠为对照。3.BFP保护视网膜节细胞作用研究：将48只健康成年S-D大鼠随机分为四组：A组（损伤+BFP治疗组）、B组（损伤组）、C组（损伤+PBS对照组）和D组（正常大鼠对照组）。每组12只大鼠,左眼为损伤眼,右眼为正常对照组。A组制成视神经横断损伤大鼠模型,并在损伤眼玻璃体腔注射BFP溶液（100ug/m1）10ul；B组制成视神经横断损伤大鼠模型；C组制成视神经横断损伤大鼠模型,损伤眼玻璃体腔注射同等体积PBS；D组不进行视神经损伤及玻璃体腔注射。选择第二部分中p-淀粉样蛋白表达水平最高的时间点,①采用Western-blotting技术检测model组及sham组四个时间点的β-淀粉样蛋白的表达；②采用半定量RT-PCR技术检测Bcl-2 mRNA、Bax mRNA以及Caspase-3 mRNA在视网膜内的表达水平。结果1.成功建立改良大鼠视神经横断模型：①FG逆行标记进行RGC计数及RGCs标识率：model组各时间点损伤眼RGCs计数（3h组152.06±15.21,48h组103.19±10.55,7d组61.89±27.38,14d组52.10±20.56）与control组（3h组195.16±22.12,48h组188.26±16.16,7d组187.76±21.19,14d组199.46±13.67）比较,差异均有显著性（P<0.05）。而sham组与control组比较,差异无显著性（P>0.05）。②组织病理改变：model组HE染色：视神经横断损伤后,视网膜神经节细胞层出现核固缩、视网膜各层变薄、细胞排列紊乱、视网膜神经节细胞减少,致伤后不同时间点上述改变的程度不同,表现为随损伤后时间延长而加重。Sham组及control组未见明显病理改变。2.β-淀粉样蛋白在视神经横断大鼠视网膜内的表达上调,同时Bcl-2下调、Bax及Caspase-3上调：①应用Western-blotting技术检测：model组各时间点β-淀粉样蛋白表达水平与control组比较,均上调,且差异有显著性（P<0.05）。其中,以48h时间点上调的最高。而sham组与control组比较,差异无显著性（P>0.05）。②应用免疫组化技术观察：光镜下model组视网膜节细胞层、内核层及内丛状层均可见β-淀粉样蛋白明显表达,呈黄色～棕褐色颗粒状分布。且48h时间点的着色最深、数量最多。而sham组与control组大鼠视网膜及视神经内未见明显β-淀粉样蛋白的表达。③应用RT-PCR技术检测：model组Bcl-2 mRNA（抗凋亡因子）表达下调,而Bax mRNA（促凋亡因子）与Caspase-3 mRNA（促凋亡因子）的表达上调。亦即：Bcl-2/Bax的比值下降,而Caspase-3 mRNA表达水平上升,且与control组比较,差异有显著性（P<0.05）。同时,sham组与control组比较,差异无显著性（P>0.05）。3.BFP下调视神经横断大鼠视网膜内p-淀粉样蛋白表达,同时上调Bcl-2、下调Bax及Caspase-3表达：①应用Western-blotting技术检测：A组（损伤+BFP治疗组）与B组（损伤组）相比,p-淀粉样蛋白的表达明显下降,差异有显著性（P<0.05）。但与D组比较,β-淀粉样蛋白的表达水平仍处于升高状态,差异有显著性（P<0.05）。同时,B组（损伤组）与C组（损伤+PBS对照组）比较,差异均无显著性（P>0.05）。表明玻璃体腔注射这一干预方式对,β-淀粉样蛋白表达的影响没有意义。②应用RT-PCR技术检测：A组（损伤+BFP治疗组）与正常对照组大鼠比较,仍有Bcl-2/Bax的比值下降和Caspase-3 mRNA表达水平上升,且差异有显著性（P<0.05）。但是,A组（损伤+BFP治疗组）与B组（损伤组）比较,Bcl-2/Bax的比值下降和Caspase-3 mRNA表达水平上升的情况明显减轻,且差异有显著性（P<0.05）。同时,B组（损伤组）与C组（损伤+PBS对照组）比较,差异均无显著性（P>0.05）。表明玻璃体腔注射这一干预方式对Bcl-2mRNA、Bax mRNA以及Caspase-3 mRNA表达的影响没有意义。结论1.应用显微剪纵行剥开视神经外膜,在外膜内、球后2 mm处离断视神经；能成功建立改良视神经横断损伤动物模型。2.β-淀粉样蛋白在视神经横断大鼠的视网膜中的表达显著上调,推测β-淀粉样蛋白参与视网膜节细胞的凋亡过程。而且β-淀粉样蛋白致视神经损伤的机制是通过Bcl-2/Bax、Caspase-3途径起作用的。3.乌鸡白凤丸有效成分（BFP）玻璃体腔注射通过下调β-淀粉样蛋白的水平、调节Bcl-2/Bax和Caspase-3的表达发挥保护视网膜节细胞作用。
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