花生根结线虫致病相关基因的克隆与鉴定及分支酸变位酶基因功能的研究

论文摘要

根结线虫（Meloidogyne spp．）是世界范围内的重要植物病原物，在中国，根结线虫从南到北都有分布，侵染多种作物品种，造成的损失高达70％。目前，防治根结线虫的主要手段有，农药防治和抗性基因的筛选和应用。已经从多种植物中鉴定到了抗根结线虫的基因。其中最有效的抗性基因是Mi基因，它可以有效地抗三种主要的根结线虫，花生根结线虫（M．arenaria）、南方根结线虫（M．incognita）和爪哇根结线虫（M．javanica）。抗性的表型是在线虫侵入点附近产生过敏性坏死反应。Mi基因是从野生番茄品种Lycopersicon peruvianum中得到的，目前国外种植的抗性番茄品种都含有这一抗性基因。但是随着栽种面积的不断扩大和时间的积累，逐渐出现了能克服抗性基因的毒性根结线虫群体。目前，对于其中的分子机理研究的很少。 在植物和微生物中，分支酸变位酶位于莽草酸代谢途径的末端，催化分支酸转化成预石炭酸盐，为苯丙氨酸和酪氨酸的合成提供前体。分支酸是许多复合物（Chorismate-derived complexes，CDCs）的前体，包括和植物防卫相关的水杨酸，芳香族氨基酸，吲哚乙酸和许多次级代谢产物。线虫的分支酸变位酶对这些生理途径的干扰可能会破坏一般的植物防卫反应，改变CDCs的水平，如水杨酸或吲哚乙酸，甚至破坏植物细胞壁的结构。 第一个动物源的分支酸变位酶（Mj-cm-1）来自爪哇根结线虫（M．javanica），它在线虫的食道腺中表达。在大豆的须根中表达MJ-CM-1蛋白，限制维管束细胞的分化和侧根的形成，但是具体机制尚不明了。源自大豆胞囊线虫（Heterodera glycines）的分支酸变位酶Hg-cm-1显示出和毒性相关的多态性。研究表明，Hg-cm-1等位基因帮助大豆胞囊线虫适应特定的大豆寄主。最近，分别从南方根结线虫，大豆胞囊线虫和马铃薯胞囊线虫（Globodera rostochiensis）中克隆到了分支酸变位酶。但是目前尚无有关花生根结线虫分支酸变位酶的研究报道，分支酸变位酶在植物寄生线虫和寄主互作中的具体作用尚未得到清楚的阐明。 鉴于以上所述原因，本文主要开展了以下研究工作。 1．利用抑制差减杂交（Suppression Subtractire Hybridization，SSH）方法分离致病相关基因 以一对M．arenaria无毒和毒性近等基因系（near-isogenic lines，NIL）为材料，用抑制差减杂交技术（Suppression Subtractive Hybridization，SSH）建立

论文目录

• 原创性声明
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• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 上篇 文献综述
• 第一章 根结线虫与寄主互作的研究进展
• 1 根结线虫几个主要的分泌器官
• 1.1 头感器和侧尾腺
• 1.2 排泄系统和直肠
• 1.3 表皮
• 1.4 侧器
• 1.5 食道腺
• 2 几种主要线虫分泌的蛋白
• 2.1 14-3-3蛋白
• 2.2 β-1，4-内切葡聚糖酶
• 2.3 蛋白酶
• 2.4 分支酸变位酶
• 2.5 钙网蛋白
• 2.6 乙酰胆碱酯酶
• 2.7 泛素延展蛋白
• 2.8 毒性或无毒蛋白
• 3 小结
• 第二章 根结线虫与寄主互作的研究技术和方法
• 1 毒性和无毒近等基因系
• 2 根结线虫和寄主互作研究中常用的方法和技术
• 2.1 蛋白质组学直接分析线虫口针分泌物
• 2.2 候选基因策略
• 2.3 构建食道腺细胞特异性cDNA文库
• 2.4 差异显示方法
• 2.4.1 扩增片段长度多态性
• 2.4.2 抑制差减杂交
• 2.4.3 代表性差异分析
• 3 得到基因全长的主要方法
• 3.1 构建基因组文库或cDNA文库
• 3.2 反向PCR
• 3.3 cDNA末端快速扩增
• 4 研究植物病原线虫致病基因功能的方法
• 4.1 RNA干涉（RNA Interference，RNAi）
• 4.1.1 RNAi的发现
• 4.1.2 线虫中RNAi的机制
• 4.1.3 RNAi技术在防治植物寄生线虫中的潜力
• 4.1.4 取食管和dsRNA的摄取
• 4.1.5 RNAi的特异性
• 4.1.6 效果及可持续性
• 4.1.7 生物安全性
• 4.2 转化植物
• 第三章 植物抗线虫基因
• 1 植物抗病基因的分类
• 2 植物的抗线虫基因
• Pro-1'>2.1 Hs1^Pro-1
• 2.2 Gpa2
• 2.3 Mi-1
• 3 抗线虫基因的抗性机制
• 3.1 Mi基因的抗性机制
• 3.2 其它抗线虫基因的抗性机制
• 参考文献
• 下篇 研究内容
• 第一章 抑制差减杂交法克隆花生根结线虫致病相关基因
• 1 材料与方法
• 1.1 线虫的培养
• 1.2 侵染前及侵染后二龄幼虫的分离与收集
• 1.3 核酸的提取
• 1.4 抑制差减杂交
• 1.5 构建抑制差减杂交cDNA文库
• 1.6 反向Northern blot初步筛选差异表达的cDNA片段
• 1.7 RT-PCR进一步筛选差异表达的cDNA片段
• 2 结果
• 2.1 抑制差减杂交效率
• 2.2 抑制差减杂交cDNA的转化
• 2.3 菌落 PCR筛选阳性克隆
• 2.4 反向Northern blot初步筛选差异表达的cDNA片段
• 2.5 RT-PCR进一步筛选差异表达的cDNA片段
• 2.6 差异表达的cDNA片段的序列分析
• 3 讨论
• 第二章 代表性差异分析法克隆花生根结线虫致病相关基因
• 1 材料与方法
• 1.1 线虫的培养
• 1.2 侵染前及侵染后二龄幼虫的分离与收集
• 1.3 核酸的提取
• 1.4 RDA
• 1.4.1 准备Driver-cDNA
• 1.4.2 第一轮 RDA
• 1.4.3 DpnII酶切除去J接头
• 1.4.4 第二轮 RDA
• 1.4.5 DpnII酶切除去N接头
• 1.4.6 第三轮 RDA
• 1.4.7 DpnII酶切除去J接头
• 1.4.8 第四轮 RDA
• 1.5 差异表达的cDNA片段的凝胶回收
• 1.6 TA克隆连接反应
• 1.7 转化
• 1.8 转化子PCR筛选
• 1.9 RT-PCR进一步筛选及验证差异表达的cDNA片段
• 2 结果
• 2.1 四轮 RDA
• 2.2 菌落 PCR筛选阳性克隆
• 2.3 RT-PCR进一步筛选及验证差异表达的cDNA片段
• 2.4 差异表达的cDNA片段的序列分析
• 3 讨论
• 第三章 cDNA末端快速扩增法扩增差异表达基因的全长cDNA
• 1 材料与方法
• 1.1 引物设计与合成
• TM RACE Amplilfication Kit，Clontech)'>1.2 RACE(The SMART^TM RACE Amplilfication Kit，Clontech)
• 1.3 克隆目标片段
• 1.4 序列分析
• 2 结果
• 2.1 3’-RACE
• 2.2 5’-RACE
• 2.3 序列分析
• 2.3.1 cDNA序列拼接
• 2.3.2 cDNA核酸序列分析
• 2.3.3 氨基酸序列分析
• 2.3.3.1 对AV-250的氨基酸序列分析
• 2.3.3.2 对AV-550的氨基酸序列分析
• 2.3.3.3 对AV-500的氨基酸序列分析
• 3 讨论
• 第四章 花生根结线虫分支酸变位酶cDNA的克隆和分析
• 1 材料与方法
• 1.1 根结线虫的培养
• 1.2 根结线虫的孵化
• 1.3 侵染前及侵染后二龄幼虫的分离与收集
• 1.4 mRNA的提取
• 1.5 应用cDNA末端快速扩增法克隆分支酸变位酶全长cDNA
• 1.6 克隆目标片段
• 1.7 分支酸变位酶cDNA序列的生物信息学分析
• 1.8 分支酸变位酶的发育表达模式
• 1.9 分支酸变位酶的原位杂交分析
• 1.10 从毒性花生根结线虫群体中克隆分支酸变位酶
• 1.11 Virtual Northern分析分支酸变位酶的表达差异
• 2 结果
• 2.1 花生根结线虫的分支酸变位酶基因
• 2.2 分支酸变位酶氨基酸序列的多重序列比对
• 2.3 分支酸变位酶发育表达模式
• 2.4 分支酸变位酶的组织定位
• 2.5 从毒性花生根结线虫中扩增分支酸变位酶
• 2.6 Virtual Northern分析分支酸变位酶的表达差异
• 3 讨论
• 参考文献
• 附录一 用不同的RACE方法扩增花生根结线虫的Actin基因5’cDNA末端
• TM RACE（Clontech）'>1 方法一: SMART^TMRACE（Clontech）
• 2 方法二: RNA ligase-mediated RACE
• 2.1 合成ss cDNA
• 2.2 消化杂合的RNA
• 2.3 连接GR-5’-Oligo
• 2.4 RACE
• 3 方法三: Modified from the instrction manual for Roche’s RACE Kit
• 3.1 第一条cDNA链的合成与纯化
• 3.2 消化杂合的RNA
• 3.3 加Poly（A）尾
• 3.4 PCR扩增
• 4 结果
• 附录二 各章中用到的引物或寡聚核苷酸序列
• 攻读博士学位期间发表或已被接受的研究论文
• 致谢