肠道病毒71型分子流行病学调查及miRNA抑制肠道病毒71型体外复制的研究

论文摘要

2008年3月份,安徽省阜阳市发生了较大规模的手足口病疫情。随后,疫情蔓延至全国。2008年5月2日,卫生部已将手足口病列入传染病防治法规定的丙类传染病进行管理。近年来,手足口病疫情不断暴发,手足口病发病数位居丙类传染病之首,对我国人民的卫生健康造成了严重威胁,今后一段时间疫情可能进一步上升,防控形势十分严峻。手足口病（Hand, foot and mouth disease, HFMD）是由小RNA病毒科的多种肠道病毒引起的传染病,主要有：柯萨奇病毒A组的4、5、7、9、10、16型；柯萨奇病毒B组的2、5型；肠道病毒71型以及埃可病毒,其中以柯萨奇病毒A16型（CoxA16）和肠道病毒71型（EV71）最常见。一般来说,手足口病的症状轻微,约在10-14天左右自愈。但EV71引起的手足口病有时引起神经系统症状,甚至导致死亡。目的：本研究拟建立针对手足口病和EV71的快速检测方法,持续监测手足口病；调查了解镇江市手足口病的流行病学特点,在手足口病的高发时段和高发人群加强防控；研究了解江苏省EV71的基因特征,以便更好的了解EV71病毒的起源地、变异规律和流行途径,防范EV71的大规模流行。目前,针对EV71的感染尚无特异性的预防疫苗、治疗方法和抗病毒药物。因此,尚需深入研究EV71的致病机制,尤其是EV71引发重症感染的机制。本研究利用肠道病毒易感细胞RD细胞分离EV71病毒株,将EV71感染SK-N-SH神经细胞后,利用miRNA芯片比较神经细胞感染EV71前后miRNA的变化,筛选出差异表达的miRNA。寻找并验证miRNA对EV71病毒感染神经细胞的干预作用,为今后利用miRNA治疗EV71感染提供理论和实验基础。方法：（1）手足口病通用病原和肠道病毒71型检测方法的建立利用TaqMan-LNA探针建立多重荧光定量RT-PCR方法,同时检测肠道病毒71型（EV71）和肠道病毒通用型（EV-U）,使用含有目的序列RNA标准品制备标准曲线,对病毒进行准确定量,同时对该方法的特异性、灵敏度、重复性进行评估,并对临床样品进行检测。（2）镇江市2009-2010年手足口病的流行病学调查以镇江市2009年1月1日-2010年12月31日诊断为手足口病的9899例患者（按发病日期统计）为研究对象,采用描述性流行病学方法对本市手足口病的流行特征进行分析。（3）江苏省肠道病毒71型分子流行病学调查采集临床手足口病（HFMD）患者咽拭子标本,抽提病毒RNA,通过巢式PCR扩增肠道病毒71型vp1基因的核苷酸序列。利用Clustal X和MEGA5.0分析软件,进行同源性分析并构建系统发生树。（4）肠道病毒71型感染神经细胞后miRNA的变化利用RD细胞分离EV71病毒,将EV71感染SK-N-SH神经细胞,分别提取EV71感染SK-N-SH神经细胞前后的RNA,利用miRNA芯片筛选EV71感染SK-N-SH神经细胞前后表达差异的miRNA。选择部分表达差异和无差异的代表性miRNA,进行实时荧光定量PCR,验证miRNA芯片的分析结果。（5）miRNA对EV71复制的调控选取EV71感染SK-N-SH神经细胞前后表达差异显著的miRNA,合成miRNA模拟体和抑制体,转染SK-N-SH神经细胞后,与空白、阴性对照组同时感染EV71,通过观察细胞病变效应（CPE）、Western Blot、实时荧光定量PCR比较EV71的复制情况,分析miRNA对EV71复制的调控。结果：（1）本研究建立了基于TaqMan-LNA探针的多重荧光定量RT-PCR方法,能同时定量检测肠道病毒71型（EV71）和肠道病毒通用型（EV-U）,该法特异性为100%,灵敏度达到102拷贝/μL,重复性好。（2）镇江市2009-2010年报告儿童手足口病全年散发,手足口病的发病病例主要有两个高峰期,一个主要的高峰期集中在4、5、6月份,三个月报告病例占全年疫情总数的56.2%。另一个较小的高峰期出现在11到12月,两个月报告病例占全年疫情总数的17.4%。镇江市发病人群以1-3周岁儿童为主,3岁及以下病例占总病例数的69.22%。职业分布以散居儿童和幼托儿童为主,占总病例数的95.6%,且男孩发病率略高于女孩,乡村地区发病率高于城镇。（3）序列进化分析表明,江苏省的EV71病毒基因与C基因型代表株比较接近,尤其与C4基因亚型最为相近,并且可进一步划分为C4a进化枝。说明江苏省EV71病毒皆属于EV71病毒C基因型、C4a亚型。（4）对miRNA杂交芯片进行分析,筛选出EV71感染神经细胞感染后/感染前>1.50为上调基因,EV71感染神经细胞感染后/感染前<0.65为下调基因。EV71感染SK-N-SH神经细胞后与感染前相比,共有116个miRNA显著表达异常,其中上调的miRNA有46个,下调的miRNA有70个。荧光定量PCR的结果与miRNA芯片结果基本一致。（5）miR-27a和miR-23b模拟体转染SK-N-SH神经细胞后,将EV71感染神经细胞,与空白、阴性对照相比,miR-27a and miR-23b模拟体转染组的细胞病变效应没有显著变化；荧光定量PCR结果显示miR-27a和miR-23b模拟体转染组的EV71病毒RNA没有明显变化；Western Blot结果显示miR-27a和miR-23b模拟体转染组的EV71病毒VPl蛋白明显少于空白和阴性对照组,并且EV71病毒滴度（TCID50）下降。结论：（1）本文建立了TaqMan-LNA探针建立多重荧光定量RT-PCR方法,能同时对EV71和EV-U进行快速定量检测,并且灵敏度高、特异性强、重复性好,适用于手足口病疫情的临床检测。（2）镇江市手足口病好发人群主要是1-3周岁儿童,以散居和幼托儿童多见,男性高于女性；发病时间存在时间规律,全年存在大小两个高峰,第一个高峰是4-5月份,第二个小高峰是11-12月份,且第一高峰强于第二高峰。EV71感染可能更易引起重症病例。（3）2009年江苏省的EV71病毒株可能与阜阳分离的EV71病毒有相同的起源,均属于C4a亚型,并且C4a亚型的EV71病毒在中国大陆有较广泛的分布和传播。（4）EV71感染SK-N-SH神经细胞后与感染前相比,共有116个miRNA显著表达异常,可能与EV71的感染和复制有关,为进一步深入研究EV71感染SK-N-SH神经细胞时,miRNA对EV71复制的调控奠定了基础。（5）miRNA-23b和miRNA-27a通过转录后水平调节EV71病毒,影响EV71蛋白的表达,从而调节EV71病毒的复制。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 手足口病
• 1.1.1 手足口病简介
• 1.1.2 手足口病流行现状
• 1.1.3 手足口病病原学
• 1.1.4 手足口病的鉴别诊断和检测方法
• 1.2 肠道病毒71型
• 1.2.1 肠道病毒71型的简介
• 1.2.2 肠道病毒71型的分子流行病学
• 1.2.3 病毒的感染与复制
• 1.2.4 肠道病毒71型的致病性和嗜神经性
• 1.2.5 肠道病毒71型的治疗
• 1.3 microRNA
• 1.3.1 microRNA简介
• 1.3.2 病毒microRNA与细胞microRNA
• 1.3.3 肠道病毒71型与microRNA
• 1.4 本研究的目的和立题依据
• 1.5 研究内容
• 第二章 用病原和肠道病毒71型检测方法的建立
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.2 结果
• 2.2.1 RNA标准品的制备和定量
• 2.2.2 标准曲线的绘制
• 2.2.3 多重荧光RT-PCR方法的建立
• 2.2.4 多重荧光RT-PCR方法的特异性、灵敏度、重复性
• 2.2.5 多重荧光RT-PCR的临床检测和验证
• 2.3 讨论
• 第三章 镇江市2009-2010年手足口病的流行病学调查
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 流行病学资料
• 3.1.2 其他资料的来源
• 3.1.3 卫生部发布的《手足口病预防控制指南》规定的手足口病病例诊断
• 3.1.4 统计与分析方法
• 3.2 结果
• 3.2.1 镇江市手足口病的疫情情况
• 3.2.2 镇江市手足口病的流行病学特点
• 3.2.6 镇江市手足口病的病原学
• 3.2.7 镇江市重症手足口病的分析
• 3.3 讨论
• 第四章 江苏省肠道病毒71型分子流行病学调查
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 结果
• 4.2.1 样品EV71/EV-U双重荧光定量RT-PCR检测结果
• 4.2.2 EV71vp1基因扩增结果
• 4.2.3 EV71基因进化树分析
• 4.3 讨论
• 第五章 肠道病毒71型感染神经细胞后microRNA的变化
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.2 方法
• 5.2 结果
• 5.2.1 EV71病毒分离和鉴定
• 5.2.2 EV71病毒滴度（TCID50）检测
• 5.2.3 EV71病毒感染人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞
• 5.2.4 总RNA的提取
• 5.2.5 EV71病毒感染SK-N-SH细胞前后miRNA芯片杂交
• 5.2.6 EV71病毒感染SK-N-SH细胞前后miRNA芯片结果
• 5.3 讨论
• 第六章 实时荧光定量PCR验证基因芯片结果
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 主要试剂
• 6.1.2 主要仪器
• 6.1.3 方法
• 6.2 结果
• 6.2.1 总RNA的提取
• 6.2.2 实时荧光定量PCR的结果
• 6.2.3 实时荧光定量PCR与芯片结果的比较
• 6.3 讨论
• 第七章 miRNA对肠道病毒71型的调控
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 方法
• 7.2 结果
• 7.2.1 miRNA模拟体和抑制体转染SK-N-SH细胞
• 7.2.2 SK-N-SH细胞病变效应比较
• 7.2.3 miRNA对EV71VP1蛋白表达的影响
• 7.2.4 miRNA对EV71病毒滴度（TCID50）的影响
• 7.2.5 miRNA对EV71RNA的影响
• 7.2.6 qRT-PCR验证转染后miRNA含量变化
• 7.2.7 利用生物学软件预测miRNA的靶基因
• 7.3 讨论
• 第八章 主要结论及展望
• 8.1 主要结论
• 8.2 创新点
• 8.3 展望
• 参考文献
• 在读期间已发表的论文
• 致谢