豆粕的萌前除草活性及其对土壤微生物的生态效应

论文摘要

杂草危害是农业生态系统和城市草坪管理中面临的主要问题之一。杂草的化学防治一直是杂草控制的主要手段,但化学除草剂的过度使用所带来的环境安全问题已日益受到公众的关注,而寻求天然无公害的除草剂被认为是解决这一弊端的有效途径之一。豆粕是大豆经过提取豆油后得到的一种副产品,含有40%～48%蛋白质,是一种常见的动物饲料。本文研究了豆粕及其水解物对植物种子萌发的抑制活性（以下称为萌前除草活性）及作用机制,评价了豆粕对成熟草坪植物、草坪质量及草坪土壤微生物多样性的影响。此外,还比较研究了与豆粕组成相似的玉米蛋白粉的萌前除草活性机制。上述研究为阐明豆粕乃至其他天然蛋白原料及其水解物的除草活性机制,为豆粕开发成天然萌前除草剂提供理论依据。主要研究结果如下。（1）通过培养箱及温室内植物种子发芽实验,系统地研究了不同施用量的豆粕对8种植物的萌前除草活性。结果表明:无论是在培养箱实验条件还是温室盆栽条件下,豆粕均能有效抑制植物种子萌发时根的生长发育并降低植物种子相对发芽率。豆粕的萌前除草活性具有种间差异,总体上看,豆粕对双子叶植物具有更强的萌前除草活性。培养箱实验条件下,豆粕施用量为7 mg/mL时,豆粕对野菊（Dendranthema indicum）、胜红蓟（Ageratum conyzoides）、水蜈蚣（Kyllingabrevifolia）、三叶鬼针草（Bidens pilosa）等杂草根长抑制率达到100%,而对多年生黑麦草（Lolium perenne）、一年生黑麦草（Lolium multiflorum）、杂三叶（Trifolium hybridum）等草坪植物种子萌发的根长抑制率为86%、52%和79%。无菌条件下,豆粕的萌前除草活性明显下降,当豆粕施用量达到10 mg/mL时,对多年生黑麦草和红三叶（Trifolium pratense）的根长抑制率（＜32%）远远低于非无菌条件下对这2种植物的根长抑制率（＞90%）,从而证实了微生物在豆粕的萌前除草活性中起重要作用。培养箱实验条件下,各施用量豆粕液萌前除草活性实验前的pH为6.63-7.10,氨氮含量为1.07-1.63 mg/L之间,萌前除草活性实验后pH上升到8.26-8.86,氨氮含量上升到25.98-232.47 mg/L,而硝态氮及亚硝态氮含量少,除草活性实验前后变化很小。分析认为,豆粕液经过微生物分解所产生的游离氨是豆粕释放的除草活性物质。温室盆栽条件下,豆粕表施和混施2种施用方式对8种植物均有不同程度的萌前除草活性,混施比表施对植物根的生长有更强的抑制活性。（2）用碱性蛋白酶水解豆粕制备出豆粕水解物,分析了其萌前除草活性及作用机制。结果显示:在培养箱及温室条件下,豆粕水解物比豆粕有更高的除草活性。无菌条件下不同浓度的豆粕水解物（0.5 meg/mL、1mg/mL、1.5 mg/mL、2.0 mg,/mL）使多年生黑麦草根长增加了14%～17%,芽长增加了12%～14%,说明无菌条件下豆粕水解物没有除草活性。豆粕水解物除草活性前后pH及氨氮变化趋势与豆粕液的非常相似,说明豆粕水解物与豆粕具有相同的萌前除草活性机制,即豆粕水解物在微生物作用下所释放的游离氨是除草活性物质。（3）用超滤法制备不同相对分子质量分别为＞10000 Dal、5000-10000 Dal、3000-5000 Dal、1000-3000 Dal、＜1000 Dal的豆粕水解肽组分,发现不同相对分子质量的豆粕水解肽在相同氮含量条件下的除草活性无显著差异,并从相对分子质量小于1000 Dal的豆粕水解肽组分中分离纯化出一个6肽单体（Tyr-Ser-Tyr-Pro-Pro-Arg）,分离过程中各多肽组分对多年生黑麦草的根抑制活性无显著差异,这些结果证实了豆粕及其水解物除草活性来源于其中的蛋白质或多肽部分,但豆粕水解肽的除草活性与其相对分子质量没有相关性。（4）通过培养箱发芽实验进一步比较玉米蛋白粉与豆粕的除草机制。结果表明:无菌条件下,玉米蛋白粉的除草活性急剧下降,玉米蛋白粉水解物还促进了多年生黑麦草的种子萌发及幼苗生长。无菌条件下,玉米蛋白粉及其水解物培养液的pH及氨氮基本上没有变化,而非无菌培养条件下,pH及氨氮急剧上升。此外,相同氮含量条件下,不同相对分子质量多肽的萌前除草活性没有显著差异。此项结果证明了豆粕、玉米蛋白粉等天然蛋白原料具有相同的萌前除草机制。（5）豆粕胁迫条件下,多年生黑麦草种子萌发及幼苗生长过程中SOD、POD、CAT活性及MDA、可溶性蛋白、可溶性糖含量表现出先升高后下降的趋势,各处理的SOD、POD、CAT活性均高于对照,不同处理SOD活性最高值发生在第10天至12天,POD活性最高值发生在第7天,CAT活性最高值发生在第7天至第10天。（6）以华南地区广泛栽培的草坪草——细叶结缕草（Zoysia tenuifolia）为研究对象,研究不同的豆粕施用量对细叶结缕草生长、草坪质量及光合作用特性的影响。结果表明:豆粕含有7%左右的氮,为秋冬季细叶结缕草草坪的生长提供了丰富的氮肥源,提高了植物体内硝酸还原酶活性,增加了氮素的吸收,使草坪草的光合能力增强,促进了草坪的生长,增加了草坪的生物量,有效地改善了草坪颜色、均一度,延长了细叶结缕草草坪绿期。（7）通过土壤酶活性分析,传统的微生物培养法以及PCR-DGGE、RAPD等分子生物学技术研究豆粕对草坪土壤微生物多样性的影响。结果显示:豆粕对多数土壤酶活性影响不大,特别是到实验后期,多数土壤酶活性与对照没有显著差异,只有高施用量（300 g/m2）豆粕能较长时间地提高蛋白酶活性;豆粕只能在一定时间内增加土壤微生物的数量,随着豆粕的分解,养分被草坪植物吸收及渗漏流失,豆粕对土壤微生物的影响逐步减弱,加之土壤微生物的自身调节能力,豆粕处理后期对土壤微生物的数量总体影响比较小;PCR-DGGE指纹图谱分析显示出,高施用量的豆粕在施用后14天内一定程度上增加了草坪土壤细菌的丰富度、多样性指数及均匀度,但第28天时这些指标与对照无显著差异,而低用量的豆粕对草坪土壤细菌的多样性影响不大。土壤微生物RAPD指纹图谱分析表明,用豆粕一定时间内使土壤微生物的多样性增加,但实验末期（第28天）豆粕对土壤微生物的多样性的影响非常微弱。

论文目录

表索引

Table Index

图索引

Figure Index

常用缩略语

摘要

Abstract

第1章前言

1.1 天然除草活性产物的研究进展

1.1.1 杂草的危害现状、天然产物控制杂草的内涵及意义

1.1.2 抑制杂草生长的生物体及其残体

1.1.3 植物粗提物对杂草的控制

1.1.4 纯化合物的除草活性

1.1.5 天然除草活性化合物的发现途径与分离

1.2 土壤微生物多样性研究进展

1.2.1 土壤管理方式对土壤微生物的影响

1.2.2 土壤微生物多样性研究方法

1.3 论文思路、研究意义及主要研究内容和技术路线

1.3.1 论文思路与研究意义

1.3.2 研究内容与技术路线

第2章材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 供试植物

2.1.2 制备除草活性物质的原料

2.2 仪器和试剂

2.2.1 实验仪器

2.2.2 实验试剂

2.3 豆粕、玉米蛋白粉营养成分与矿质元素测定

2.3.1 营养成分的测定

2.3.2 矿质元素的测定

2.4 豆粕及玉米蛋白粉水解物的制备

2.4.1 酶解反应

2.4.2 浓缩干燥

2.4.3 超滤法制备不同相对分子质量范围的水解肽组分

2.5 培养箱内除草活性实验

2.5.1 豆粕及玉米蛋白粉除草活性实验

2.5.2 豆粕及玉米蛋白粉水解物的除草活性实验

2.5.3 无菌条件下除草活性实验

2.5.4 不同相对分子质量的豆粕水解肽、玉米蛋白粉水解肽的除草活性实验

2.6 温室盆栽除草活性实验

2.6.1 豆粕除草活性实验

2.6.2 豆粕水解物的除草活性实验

2.7 除草活性培养基质的pH及无机氮测定

2.8 豆粕水解肽的分离纯化

2.8.1 离子交换层析分离

2.8.2 凝胶层析分离

2.8.3 RP-HPLC分离

2.8.4 组分蛋白含量的测定

2.8.5 组分生根抑制活性的测定

2.8.6 多肽单体相对分子质量测定及序列分析

2.9 豆粕对多年生黑麦草种子萌发及幼苗早期生长发育的生理生化特性影响

2.9.1 实验处理

2.9.2 测定指标及方法

2.10 豆粕对细叶结缕草草坪质量影响的研究

2.10.1 试验区自然概况

2.10.2 供试草坪及处理方法

2.10.3 测试项目与方法

2.11 豆粕对草坪土壤微生物多样性影响的研究

2.11.1 试验处理

2.11.2 土壤酶活性的测定

2.11.3 土壤微生物类群数量测定

2.11.4 土壤微生物DGGE检测

2.11.5 土壤微生物RAPD检测

2.12 数据处理

第3章豆粕的萌前除草活性分析

3.1 豆粕营养成分与矿质元素

3.2 豆粕培养箱内除草活性

3.3 温室内豆粕萌前除草活性

3.4 豆粕培养液除草活性实验前后pH及无机氮的变化

3.5 无菌培养条件下豆粕粉的除草活性

3.6 本章小结

第4章豆粕水解物的萌前除草活性分析

4.1 豆粕水解物及不同相对分子量水解肽物理性质及蛋白质含量

4.2 培养箱内豆粕水解物萌前除草活性

4.3 豆粕水解物温室盆栽萌前除草活性

4.4 豆粕水解物无菌条件下除草活性

4.5 不同相对分子质量豆粕水解肽对多年生黑麦草种子萌发生根的抑制作用

4.6 本章小结

第5章豆粕水解肽的分离纯化及除草活性分析

5.1 离子交换层析对豆粕水解肽的分离

5.2 凝胶过滤层析对IEC-A8组分的分离

5.3 制备型C18-RP-HPLC对GFC-A2组分的分离

5.4 分析型RP-HPLC对P-H-3组分的分离

5.5 HPLC-1和HPLC-2峰纯度检验

5.6 HPLC-1峰组分中肽的分子量确定

5.7 多肽单体的氨基酸序列测定

5.8 多肽单体的根抑制活性

5.9 本章小结

第6章玉米蛋白粉及其水解物萌前除草活性分析

6.1 玉米蛋白粉营养成分与矿质元素

6.2 培养箱内玉米蛋白粉萌前除草活性

6.3 玉米蛋白粉培养液除草活性实验前后pH及无机氮的变化

6.4 无菌条件下玉米蛋白粉的萌前除草活性

6.5 玉米蛋白粉水解物萌前除草活性

6.6 玉米蛋白粉水解物无菌条件下萌前除草活性

6.7 不同相对分子质量玉米蛋白粉水解肽对多年生黑麦草的萌前除草活性

6.8 本章小结

第7章豆粕对多年生黑麦草种子萌发及幼苗生长过程生理生化特性影响

7.1 豆粕对抗氧化系统酶的影响

7.1.1 豆粕对SOD活性影响

7.1.2 豆粕对POD活性的影响

7.1.3 豆粕对CAT活性的影响

7.1.4 豆粕对MDA含量的影响

7.1.5 豆粕对抗氧化系统酶影响的探讨

7.2 豆粕对可溶性糖含量的影响

7.3 豆粕对可溶性蛋白含量的影响

7.4 本章小节

第8章豆粕对细叶结缕草草坪质量的影响

8.1 豆粕对草坪草颜色的影响

8.2 豆粕对草坪草均一度的影响

8.3 豆粕对草坪草叶绿素含量的影响

8.4 豆粕对草坪草组织全氮含量的影响

8.5 豆粕对草坪草硝酸还原酶活性的影响

8.6 豆粕对草坪草生物量的影响

8.7 豆粕对草坪草光合作用的影响

8.8 豆粕对细叶结缕草草坪冬季"保绿"作用的探讨

8.9 本章小结

第9章豆粕对细叶结缕草坪土壤微生物的生态效应

9.1 豆粕对土壤酶活性影响

9.1.1 豆粕对过氧化氢酶活性的影响

9.1.2 豆粕对脲酶活性的影响

9.1.3 豆粕对磷酸酶活性的影响

9.1.4 豆粕对蛋白酶活性的影响

9.2 豆粕对细叶结缕草坪土壤微生物类群数量影响

9.2.1 豆粕对土壤细菌数量的影响

9.2.2 豆粕对土壤真菌数量的影响

9.2.3 豆粕对土壤放线菌数量的影响

9.3 豆粕对结缕草草坪土壤微生物影响的DGGE分析

9.3.1 土壤微生物总DNA

9.3.2 16SrDNA V3区PCR的PCR扩增产物

9.3.3 土壤细菌DGGE图谱

9.3.4 土壤细菌丰富度的DGGE分析

9.3.5 土壤细菌多样性指数的DGGE分析

9.3.6 土壤细菌均匀度指数的DGGE分析

9.4 豆粕对结缕草草坪土壤微生物影响的RAPD分析

9.4.1 多态位点比率

9.4.2 Shannon指数估计的处理内多样性

9.4.3 Shannon指数估计的处理间多样性

9.4.4 随处理时间变化的多态位点条带数

9.5 本章小结

第10章总结

10.1 主要结论

10.2 主要创新点

10.3 研究的不足与展望

参考文献

主持和参与的科研项目及科研成果

致谢

附图

豆粕的萌前除草活性及其对土壤微生物的生态效应

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