海洋真菌灰绿青霉HUC-5菌株抗肿瘤活性物质的初步研究

论文摘要

近年来，海洋天然产物的研究一直是国内外研究的热点领域。筛选活性物质为海洋药物提供先导化合物是目前海洋天然产物研究的重要组成部分。本文进行了海洋抗肿瘤活性菌株的筛选，海洋真菌HUC-5抗肿瘤活性化合物的初步分离及其抗肿瘤机理的研究。对本实验室的26株海洋真菌，采用MTT法进行了抗肿瘤活性筛选，有9株菌具有较强的体外抗肿瘤活性（≥50%），占总供测菌株的34.6%，其中有6株对宫颈癌Hela细胞有抑制活性，对小鼠肾上腺嗜铬瘤细胞PC-12细胞有抑制作用的共5株。另外，有2株对Hela、PC-12细胞株均有抑制活性，对HUC-5菌株进行了菌种鉴定、发酵液的乙酸乙酯提取物进行了部分理化性质检测，并对乙酸乙酯提取物及其初步纯化产物的抗肿瘤活性进行了初步研究。对菌株HUC-5进行了形态学鉴定，根据其菌落形态、产孢结构等形态特征，初步鉴定该菌为灰绿青霉（Penicilliumglaucum）。对菌株HUC-5乙酸乙酯提取物部分理化性质的研究结果显示，与常温对照组相比，该菌的乙酸乙酯提取物在40-50℃左右保持较好的活性，温度80℃时活性下降66%，90℃时仅保持22.6%的活性，在100℃及以上温度时活性完全丧失。对该菌发酵液中抗肿瘤活性物质的溶解性质测定表明，活性成分溶于乙酸乙酯、甲醇等有机溶剂，其中在乙酸乙酯中溶解性最好。对菌株HUC-5乙酸乙酯提取物的抗肿瘤作用研究表明，HUC-5乙酸乙酯提取物具有广谱的抗肿瘤细胞活性，对Hela、小鼠黑色素瘤细胞B-16、人乳腺导管癌细胞BT474、人喉癌Hep-2、PC-12均有抑制活性，其中对Hep-2肿瘤细胞抑制性最强，在0.4mg/mL浓度下，达到96.7%，且抑制作用具有时间和剂量依赖性，IC50为0.12mg/mL。镜检发现处理的Hep-2细胞在形态表现为染色质浓缩，细胞收缩，及类似凋亡小体。通过彗星电泳实验结果显示，0.4mg/mL乙酸乙酯提取物对Hep-2细胞DNA有重度损伤；琼脂糖凝胶电泳结果显示出典型的DNAladder；流式细胞术检测结果表明，在分别处理16h，32h时，Hep-2都有明显的细胞凋亡，凋亡率分别为45.85%和86%。菌株HUC-5乙酸乙酯提取物主要通过诱导Hep-2细胞凋亡，从而抑制肿瘤细胞的增殖。通过Sephadex LH-20柱色谱初步分离抗肿瘤活性成分，并检测其抗肿瘤活性，结果显示有5组成分抗肿瘤活性相对较高，活性分别为15.65%、10.69%、14.48%、16.99%、18.11%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 文献综述
• 1 引言
• 1.1 研究价值和理论意义
• 1.2 本研究拟解决的问题
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 仪器设备与试剂
• 2.1.2 菌种
• 2.1.3 细胞株
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 主要试剂的配制
• 2.2 方法
• 2.2.1 细胞培养
• 2.2.2 抗肿瘤活性菌株的筛选
• 2.2.3 菌株 HUC5 的鉴定
• 2.2.4 菌株 HUC5 乙酸乙酯提取物合成量与发酵时间的关系
• 2.2.5 菌株 HUC5 乙酸乙酯提取物活性组分部分理化性质测定
• 2.2.6 菌株 HUC5 乙酸乙酯提取物抗肿瘤作用及其机理的研究
• 2.2.7 菌株 HUC5 乙酸乙酯提取物抗肿瘤活性物质的分离
• 2.3 数据处理与统计学分析
• 3 结果分析
• 3.1 抗肿瘤活性细胞株的筛选
• 3.2 菌株 HUC5 的鉴定
• 3.3 菌株 HUC5 乙酸乙酯提取物合成量与发酵时间的关系
• 3.4 菌株 HUC5 乙酸乙酯提取物活性组分部分理化性质测定
• 3.4.1 不同温度对菌株 HUC5 乙酸乙酯提取物抗肿瘤活性的影响
• 3.4.2 菌株 HUC5 乙酸乙酯提取物抗肿瘤活性物质溶解性测定
• 3.5 菌株 HUC5 乙酸乙酯提取物抗肿瘤作用及其机理的研究
• 3.5.1 菌株 HUC5 乙酸乙酯提取物对不同细胞株的抑制活性
• 3.5.2. 不同处理时间，乙酸乙酯提取物对 H e p 2 细胞抑制活性的测定
• 3.5.3 菌株 HUC5 乙酸乙酯提取物对 H e p 2 细胞形态学影响
• 3.5.4 彗星电泳检测 Hep2 细胞 DNA 的损伤
• 3.5.5 琼脂糖凝胶电泳检测乙酸乙酯提取物诱导 Hep 2 细胞凋亡
• 3.5.6 流式细胞术检测 Hep2 细胞凋亡率
• 3.6 菌株 HUC5 抗肿瘤活性物质的分离
• 4 讨论
• 4.1 具抗肿瘤活性物质菌种筛选
• 4.2 菌株 HUC5 的鉴定
• 4.3 菌株 HUC5 抗肿瘤活性研究
• 4.4 抗肿瘤活性物质的分离
• 5 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 在读期间发表的学术论文