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乙酰胆碱受体α-亚基胞外编码区(AChRα211)的表达及其基因免疫

2020-11-22阅读(653)

乙酰胆碱受体α-亚基胞外编码区(AChRα211)的表达及其基因免疫

论文摘要

乙酰胆碱受体（AChR）α亚基是自身免疫性疾病重症肌无力的主要免疫原,对乙酰胆碱受体α亚基结构与功能的研究是突破重症肌无力症发病机理和可能治疗手段的关键。但要从生物组织获得乙酰胆碱受体难度很大,不能满足肌无力症的机理和治疗研究的需求。利用基因工程技术,获得目的蛋白无疑是比较理想的手段。 （一） 将AChRα亚基N端主要免疫区开放阅读框分别与载体pUC18,pET-32M和pET-28a连接,构建pUC-AChRα205,pET- AChRα211,pUC-CBD-AChRα211,pET-CBD-AChRα211四种重组质粒,转化相应的宿主菌,进行培养和诱导表达。除了重组质粒pUC-AChRα205在JM109中以可溶性表达,且表达量极低以外,其他都以不溶性的包涵体形式存在。对工程菌E.coli BL21（DE3）/pET-CBD-AChRα211表达的包涵体蛋白进行了变性、复性研究,融合蛋白可被凝血酶裂解得到25 kDa的AChRα211和5.6kDa的CBD。经Western blot显示,融合蛋白和单一的AChRα211均具有与从电鳐提取的天然来源的AChRα亚基相同的免疫学活性。 （二） 选择人乙酰胆碱受体α亚基N端的主要免疫区(AChRα211)的基因片段作为核酸疫苗的靶基因,以哺乳动物穿梭质粒pcDNA3.0为载体,构建了核酸疫苗pcDNA-AChRα211。经大量提纯质粒pcDNA-AChRα211后,免疫C57BL/6小鼠。用ELISA法检测小鼠血清中抗AChRα211的抗体（AChRAb）,测定抗体滴度为320,并用PCR方法检测靶基因在小鼠各组织器官中的分布情况,经序列比对,发现在小鼠的肌肉,肝,脾,肾可检测到靶基因。重组质粒pcDNA-AChRα211作为核酸疫苗具有良好的免疫原性,能够持续诱导C57BL/6小鼠产生体液免疫应答。

论文目录

  • 目录
  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 乙酰胆碱受体与重症肌无力（综述）
  • 1 引言
  • 2 乙酰胆碱受体结构与功能
  • 2.1 乙酰胆碱受体的结构
  • 2.2 乙酰胆碱受体的作用机理
  • 2.3 乙酰胆碱受体结构与功能关系的研究
  • 3 重症肌无力形成机理及其治疗战略
  • 3.1 重症肌无力的形成机理
  • 3.2 重症肌无力的细胞免疫机理
  • 3.3 重症肌无力的可能治疗方法
  • 参考文献
  • 第二章 AChRα亚基N端主要免疫区阅读框的克隆及表达
  • 1 材料
  • 1.1 菌株与质粒
  • 1.2 工具酶及主要生化试剂
  • 1.3 免疫分析试剂
  • 1.4 主要试剂配制
  • 1.5 主要仪器
  • 2 方法
  • α205重组质粒的构建及在大肠杆菌JM109中的表达'>2.1 pUC-AChRα205重组质粒的构建及在大肠杆菌JM109中的表达
  • α205的改造：pUC-CBD-AChRα211重组质粒的构建及表达'>2.2 pUC-AChRα205的改造：pUC-CBD-AChRα211重组质粒的构建及表达
  • α211重组质粒的构建及在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达'>2.3 pET-AChRα211重组质粒的构建及在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达
  • α211重组质粒的构建及其表达和复性研究'>2.4 pET-CBD-AChRα211重组质粒的构建及其表达和复性研究
  • 3 实验结果
  • α205重组质粒的构建及在大肠杆菌JM109中的表达'>3.1 pUC-AChRα205重组质粒的构建及在大肠杆菌JM109中的表达
  • α205的改造：pUC-CBD-AChRα211重组质粒的构建及表达'>3.2 pUC-AChRα205的改造：pUC-CBD-AChRα211重组质粒的构建及表达
  • α211重组质粒的构建及在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达'>3.3 pET-AChRα211重组质粒的构建及在大肠杆菌BL21（DE3）中的表达
  • α211重组质粒的构建及其表达和复性研究'>3.4 pET-AChRα211重组质粒的构建及其表达和复性研究
  • 4 实验讨论
  • 参考文献
  • 第三章 核酸疫苗（综述）
  • 1 引言
  • 2 核酸疫苗的优势
  • 3 核酸疫苗的发展
  • 4 核酸疫苗可能的作用机理
  • 5 核酸疫苗的注射途径和方法
  • 5.1 注射途径
  • 5.2 接种方法
  • 6 免疫保护效应的评价
  • 6.1 细胞免疫检测
  • 6.2 体液免疫检测
  • 6.3 保护率的测定
  • 7 核酸疫苗的安全性问题
  • 7.1 抗DNA抗体
  • 7.2 持续表达外源抗原可能产生的不良后果
  • 7.3 宿主细胞恶性转化
  • 8 应用现状及展望
  • 参考文献
  • α211免疫C57BL／6小鼠所诱导的体液免疫应答'>第四章 核酸疫苗pcDNA-AChRα211免疫C57BL／6小鼠所诱导的体液免疫应答
  • 1 实验材料
  • 1.1 菌株与质粒
  • 1.2 实验动物
  • 1.3 工具酶及主要生化试剂
  • 1.4 免疫分析试剂
  • 1.5 主要试剂配制
  • 2 实验方法
  • α211的构建'>2.1 核酸疫苗pcDNA-AChRα211的构建
  • 2.2 重组质粒的大量提取及纯化
  • 2.3 重组质粒的免疫接种
  • 2.4 抗血清的制备
  • 2.5 小鼠血清中AChRAb的ELISA检测
  • 2.6 小鼠组织DNA的提取
  • 2.7 PCR检测组织中的目的基因
  • 3 实验结果
  • α205的鉴定'>3.1 重组质粒pUC-AChRα205的鉴定
  • α211的纯化及定量'>3.2 重组质粒pcDNA-AChRα211的纯化及定量
  • 3.3 临床症状
  • 3.4 血清中AChRAb的检测
  • 3.5 组织中目的基因的检测及序列测定
  • 4 实验讨论
  • 参考文献
  • 附录一 基本方法与技术
  • 1 各种试剂的配置
  • 2 E.coli感受态细胞的制备
  • 3 碱裂解法小量制备质粒DNA
  • 4 考马斯亮蓝染色法（Bradford法）
  • 5 Western Blot和ELISA
  • 6 实验动物的取血方法
  • 7 小鼠组织DNA的提取
  • 附录二 攻读硕士学位期间发表的论文
  • 致谢
  • 承诺书

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