狂犬病病毒M基因功能探索及L基因聚合酶活性部位的多态性分析

论文摘要

狂犬病是由狂犬病病毒引起的一种死亡率达100%的神经性传染病,人和所有温血动物都易感。该病呈世界性分布,主要发生在亚、非、欧和美洲的未发达国家,中国、印度等最为严重。WHO公布的统计数据显示,145个国家中有100个国家报导有狂犬病疫情,全球每年有6万人死于狂犬病,严重威胁着人类健康。造成本病流行的主要原因是人们预防该病的意识不到位,家养动物的免疫密度低,暴露后未能及时进行免疫治疗。本研究以日本构建的狂犬病病毒株rRC-HL cDNA克隆为基础,用反向遗传技术将广西流行狂犬病病毒GX01株的M基因替换到rRC-HL cDNA克隆,构建出含有GX01毒株M基因的RC-HL（GX01M）感染性cDNA克隆,并在BSR细胞成功拯救出突变体重组病毒rRC-HL（GXO1M）。通过测定突变体重组病毒RC-HL（GXO1M）与亲本病毒rRC-HL的生物学特性,发现突变体重组病毒RC-HL（GXO1M）的病毒滴度比亲本病毒rRC-HL低,RNA转录水平、蛋白表达水平以及在细胞间的传播能力也比亲本病毒rRC-HL低。为进一步研究GX01株M基因的功能区域,将GX01病毒的M基因推定的氨基酸序列与RC-HL进行比较,根据氨基酸的差异选定了 4个可能的功能区（M1、M2、M3和M4）,将这4个功能区分别替换到rRC-HL的cDNA中,拯救出4个重组病毒rRC-HL（GXO1M1）、rRC-HL（GX01M2）、rRC-HL（GX01M3）和 rRC-HL（GX01M4）。通过比较 4个重组病毒的生物学特性,发现重组病毒rRC-HL（GX01M2）的病毒滴度、病毒RNA量和病毒蛋白合成量、病毒灶的大小和荧光强度都比另3个病毒（rRC-HL（GXO1M1）、rRC-HL（GX01M3）和 rRC-HL（GX01M4））和亲本病毒rRC-HL显著降低,说明GX01病毒株M基因的M2区与病毒的复制、转录及病毒在细胞间的传播有关。对广西流行狂犬病病毒L基因聚合酶活性部位进行克隆和测序,与国外固定毒株和类狂犬病毒株进行序列比较分析。结果显示,广西毒株间L基因聚合酶活性部位核苷酸和推定的氨基酸同源性分别为88.7%-99.7%和96.5%-100%;与国外固定毒株之间分别为84.8%-87.5%和94.5%-99%;与类狂犬病病毒株之间分别为75.5%-79.2%和93.5%-97%。进化树分析结果表明,广西狂犬病流行毒株可分成3个群,Ⅰ群包括GX08、GX091、GX09、GX014、GX195、GX260、GXHX、GXWX、GXLA 和 GXSL,Ⅱ群包括 GX304、GX01、GX074、GX219、GXBM 和 GXPX,Ⅲ群只有GXN119。广西流行狂犬病毒株L基因聚合酶活性部位的特异性位点有第660、745和771位3个氨基酸,其中第745位点为精氨酸,而参考毒株为丝氨酸、亮氨酸或组氨酸。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 狂犬病病毒生物学特性的研究
• 1.1.1 狂犬病病毒的感染
• 1.1.2 狂犬病病毒的复制和转录
• 1.2 狂犬病病毒M基因的研究
• 1.2.1 狂犬病病毒M蛋白调控病毒的组装、出芽和释放
• 1.2.2 狂犬病病毒M蛋白调控病毒的复制和转录
• 1.2.3 狂犬病病毒M蛋白与病毒致病相关性
• 1.3 狂犬病病毒L基因的研究
• 1.4 狂犬病病毒致病性的研究
• 1.5 狂犬病病毒和宿主的相互作用
• 1.5.1 狂犬病病毒诱导细胞凋亡
• 1.5.2 狂犬病病毒抵抗宿主细胞干扰素的作用
• 1.6 狂犬病病毒的抗原性
• 1.7 狂犬病病毒疫苗的开发
• 1.8 狂犬病病毒的流行与分群
• 1.9 反向遗传技术在狂犬病病毒研究中的应用
• 1.10 本研究的目的意义
• 第二章 狂犬病病毒M基因传染性cDNA克隆的构建及其功能探索
• 2.1 材料
• 2.1.1 细胞和病毒
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 主要的仪器和试剂
• 2.1.4 引物设计与合成
• 2.2 方法
• 2.2.1 狂犬病嵌合病毒cDNA的构建（图2-1）
• 2.2.2 重组狂犬病病毒的拯救
• 2.2.3 狂犬病病毒毒价的测定
• 2.2.4 动物实验
• 2.2.5 狂犬病病毒的生长动力学实验
• 2.2.6 实时定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR）
• 2.2.7 Western blot
• 2.2.8 空斑实验
• 2.3 结果
• 2.3.1 狂犬病毒株GX01M重组病毒感染性cDNA克隆的构建
• 2.3.2 重组狂犬病病毒的拯救
• 2.3.3 狂犬病病毒毒价的测定
• 2.3.4 拯救狂犬病病毒的毒力测定
• 2.3.5 拯救狂犬病病毒生长动力学
• 2.3.6 狂犬病病毒N、M基因和看家基因p-actin实时定量PCR标准曲线的绘制
• 2.3.7 拯救狂犬病病毒的复制和转录
• 2.3.8 拯救狂犬病病毒的蛋白表达
• 2.3.9 重组狂犬病病在细胞与细胞间的传播
• 2.4 讨论
• 小结
• 第三章 狂犬病病毒M基因调控复制和转录的机理探索
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 主要仪器和材料见2.1
• 3.1.2 引物设计与合成
• 3.2 方法
• 3.2.1 嵌合狂犬病病毒感染性cDNA克隆的构建
• 3.2.2 重组狂犬病病毒突变体的拯救
• 3.2.3 重组狂犬病病毒毒价的测定
• 3.2.4 重组狂犬病病毒生长动力学实验
• 3.2.5 实时定量PCR实验
• 3.2.6 Western blot
• 3.2.7 空斑实验
• 3.3 结果
• 3.3.1 重组病毒拯救的结果
• 3.3.2 重组病毒拯救序列的鉴定
• 3.3.3 重组病毒毒价的测定
• 3.3.4 重组病毒复制和转录结果分析
• 3.3.5 重组狂犬病病毒蛋白印迹试验
• 3.3.6 重组病毒在细胞间的传播能力结果
• 3.4 讨论
• 小结
• 第四章 广西狂犬病病毒L基因聚合酶活性部位的多态性分析
• 4.1 材料
• 4.1.1 狂犬病病毒株
• 4.1.2 仪器和试剂
• 4.1.3 引物设计与合成
• 4.2 方法
• 4.2.1 病毒RNA的抽提
• 4.2.2 反转录-聚合酶链式反应
• 4.2.3 PCR产物的克隆
• 4.2.4 阳性克隆的鉴定
• 4.3 结果
• 4.3.1 广西14株狂犬病病毒野毒株PCR鉴定
• 4.3.2 广西14株狂犬病病毒L基因聚合酶活性部位的PCR扩增
• 4.3.3 广西14株狂犬病病毒L基因聚合酶活性部位重组质粒PCR和酶切鉴定
• 4.3.4 广西狂犬病病毒L基因聚合酶活性部位核苷酸和推导的氨基酸序列比较
• 4.3.5 L基因聚合酶活性部位核苷酸多态性分析
• 4.3.6 广西狂犬病病毒株L基因聚合酶活性部位的氨基酸突变分析
• 4.4 讨论
• 小结
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附章:广西蝙蝠狂犬病病毒的调查分析
• 1 材料
• 1.1 蝙蝠材料来源
• 1.2 细胞、实验动物
• 1.3 仪器试剂
• 1.4 引物设计
• 2 方法
• 2.1 病毒RNA的抽提反转录
• 2.2 Nested-PCR
• 2.3 PCR产物的克隆、鉴定和测序
• 2.4 小鼠脑内注射
• 2.5 细胞和鸡胚分离
• 2.6 基因分析
• 3 结果
• 3.1 Nested PCR检测蝙蝠狂犬病病毒结果
• 3.2 蝙蝠材料乳鼠脑内接种后Nested PCR检测狂犬病病毒结果
• 3.3 Nested PCR对蝙蝠狂犬病病毒N基因序列分析
• 3.4 进化树的构建和分析
• 3.5 狂犬病病毒在鸡胚和BHK细胞中增值检测结果
• 4 讨论
• 小结
• 参考文献
• 致谢