论文摘要
目的：为了探讨桂枝加葛根汤治疗颈椎病的的作用机理研究,建立大鼠椎间盘纤维环细胞体外培养体系,采用不通浓度的桂枝加葛根汤大鼠含药血清进行分组干预,从分子水平及超微结构水平观察桂枝加葛根汤通过影响纤维环细胞,探索其与纤维环退变关系,进而深化桂枝加葛根汤治疗颈椎病的的临床治疗作用,间接促进中药治疗颈椎病的临床推广应用。方法：（1）将80只清洁级成年SD大鼠按体质量（200-230g）随机分为4组,即空白组（20只）采用2mL生理盐水灌胃；中药低剂量组（20只）采用1mL桂枝加葛根汤药液灌胃；中药中剂量组（20只）采用2mL桂枝加葛根汤药液灌胃；中药高剂量组（20只）采用4mL桂枝加葛根汤药液灌胃。各组连续灌胃4天（2次／天）,制备不同浓度的桂枝加葛根汤大鼠含药血清。（2）通过酶消化法贴壁分离体外培养大鼠颈椎间盘纤维环细胞,采用甲苯胺蓝染色、免疫细胞化学染色和透射电镜观察对其进行表型鉴定。（3）采用自制桂枝加葛根汤含药血清对纤维环细胞进行分组干预,连续干预6天。利用透射电镜观察桂枝加葛根汤干预后纤维环细胞形态及结构的变化；采用荧光定量PCR测定各组纤维环细胞Aggrecan-mRNA表达的变化。结果：（1）纤维环细胞的体外培养和鉴定：培养的细胞具有甲苯胺蓝异染性；Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原单克隆抗体检测到培养的细胞有Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原的阳性表达；光镜观察细胞多呈近圆形、梭形或多角形,胞质内可见较多粗面内质网；透射电镜下观察细胞结构符合软骨细胞特点。（2）透射电镜下观察不同浓度桂枝加葛根汤含药血清干预后各组纤维环细胞超微结构变化：中、高剂量组细胞内粗面内质网较空白组及低剂量组明显增多,出现电子密度较大的蛋白质沉淀,以高剂量组最为明显。（3）荧光定量PCR检测桂枝加葛根汤含药血清干预后纤维环细胞中蛋白多糖Aggrecan-mRNA的表达变化：中、高剂量组Aggrecan-mRNA表达的Ct值明显高于空白组（P<0.05）,低剂量组Ct值与空白组比较无明显差异,而高剂量组Ct值明显高于中剂量组（P<0.05）。结论：1.采用酶消化法成功贴壁分离培养了纤维环细胞,完成对细胞的表型鉴定,符合纤维环细胞的特征,为后续的实验提供了前提条件。2.桂枝加葛根汤含药血清使纤维环细胞超微结构发生改变；中、高剂量组使纤维环细胞粗面内质网和核糖体数量增多,蛋白沉淀增多,这提示桂枝加葛根汤从细胞结构上增强蛋白分泌的能力。3.桂枝加葛根汤含药血清可以增强纤维环细胞Aggrecan-mRNA的表达,从转录水平上影响纤维环细胞蛋白多糖的产生。