GPV VP及NS基因克隆及其原核表达产物的研究和应用

论文题目: GPV VP及NS基因克隆及其原核表达产物的研究和应用

论文类型: 博士论文

论文专业: 预防兽医学

作者: 布日额

导师: 王君伟

关键词: 鹅细小病毒,检测,地高辛标记核酸探针检测,间接,检测,斑点,检测

文献来源: 东北农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 小鹅瘟(Goose plague, GP)是由鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)所引起的主要侵害4～20 日龄雏鹅的急性或亚急性败血性传染病,其造成的死亡率高达90-100%,是危害养鹅业最严重传染病之一。自1956 年中国学者方定一在我国扬州地区发现并进行首次报道后,世界许多养鹅国家和地区均有陆续报道。GPV 属于细小病毒科(Parvoviridae)、细小病毒属(Parvovirus)的成员。病毒整个基因组为5.1kb,含有两个阅读框,左侧阅读框编码NS1、NS2 非结构蛋白,右侧阅读框编码VP1、VP2 及VP3 结构蛋白,其中VP3 结构蛋白能够诱导机体产生中和抗体,因此VP3 基因片段是研究防治小鹅瘟基因工程苗和检测抗原的首选基因。在防治小鹅瘟实践中,GPV 全毒疫苗曾发挥了重要作用,但全毒苗的应用的确存在散毒、潜伏感染,以及对GPV 自然感染与GPV 全毒苗免疫抗体无法进行鉴别等不足,致使该病长期以来无法得到有效检测,直接影响到对小鹅瘟的有效控制。国内外学者先后建立了琼脂扩散试验、中和试验、免疫荧光抗体试验等血清学诊断方法,在一定程度上为防治小鹅瘟发挥了重要作用,但同时也存在灵敏度差、操作烦琐、检测所需时间长等不足,已不适应更有效地控制该病的需要。国外学者建立了根据GPV 核酸PCR 产物酶消化片段的大小来区别小鹅瘟与番鸭细小病毒感染的方法,但未见进一步深入应用的报道。本论文以建立完善、有效的分子生物学和免疫学检测方法,更加有效地控制小鹅瘟为目的,应用扩增GPV 部分核酸片段的特异性引物及其克隆产物分别研究和建立了对GPV DNA进行定性和半定量检测的PCR 及DIG 核酸标记探针方法。利用部分核酸片段的原核表达产物研究建立了定量及定性检测GPV 感染抗体及鉴别VP3 亚单位抗体的间接ELISA 及斑点ELISA 方法。本论文的研究内容和结果如下: 1. 克隆了GPV H1 株的VP1-VP3 核苷酸非重叠序列片段。测序结果为,克隆产物由534bp个核苷酸组成,编码178 个氨基酸残基。扩增产物测序结果与Gen Bank 公布的GPV B 参考毒株同区段序列同源性达100%。2. 利用扩增VP1-VP3 及NS1 核酸片段的两对引物建立了检测GPV 核酸的PCR 方法。两对引物只扩增GPV 模板DNA,对GPMV、AIV 等对照病毒核酸模板的PCR 呈阴性。扩增VP1-VP3 及NS1 核酸片段引物分别能从系列稀释至4.4fg、44pg 或0.01LD50、10LD50的GPV 感染鹅脏器DNA 中扩增出GPV DNA。对7 组感染鹅脏器检测结果表明,两对引物均能快速、准确地扩增出病鹅脏器中的GPV DNA,阳性检出率达100%。2001-2004 年间对多起送检病鹅的PCR 检测均获得一致的结果。但由于扩增NS1 片段引物的检出灵敏度比扩增VP1-VP3 核酸片段引物低1000 倍,因此选择扩增VP1-VP3 核酸片段的一对引物作为建立GPV PCR 检测方法的特异性引物。由于PCR 具有强大的扩增效应,能够从病鹅脏器提取DNA中直接扩增GPV DNA,从而为准确地检测GPV 提供了一项快捷、有效的方法。3. 对VP1-VP3 及NS1 核苷酸片段的扩增产物利用Digoxigenin 进行标记,建立了检测GPV 核酸的DIG 标记探针方法。两个标记探针均能与各自相应核酸片段PCR 产物、重组质粒及不同毒株的GPV 核酸发生特异性杂交,而与GPMV、AIV 核酸杂交呈阴性。VP1-VP3

论文目录:

摘要

英文摘要

1 前言

1.1 鹅细小病毒研究进展

1.1.1 小鹅瘟概述

1.1.2 鹅细小病毒病原学研究

1.1.3 小鹅瘟的流行病学、征候学及病理学

1.1.4 小鹅瘟常规诊断方法

1.1.5 小鹅瘟特异性治疗

1.1.6 小鹅瘟的疫苗免疫预防

1.2 鹅细小病毒分子生物学研究

1.2.1 GPV 病毒粒子

1.2.2 GPV 基因组结构特点

1.2.3 基因组开放阅读框及编码区排布

1.2.4 倒置末端重复序列

1.2.5 GPV 的转录与复制

1.3 鹅细小病毒结构蛋白与非结构蛋白

1.3.1 GPV 结构蛋白

1.3.2 GPV 非结构蛋白

1.4 GPV 与其它细小病毒的关系

1.4.1 GPV 与MDPV 的关系

1.4.2 GPV 与依赖病毒属成员的关系

1.4.3 GPV 与红病毒属成员的关系

1.5 GPV 结构基因及非结构基因克隆和表达产物研究与应用意义

1.5.1 结构蛋白与非结构蛋白基因克隆和表达研究

1.5.2 小鹅瘟实验室诊断方法研究

1.5.3 本课题研究目的和意义

2 材料和方法

2.1 材料

2.2 方法

2.2.1 病鹅脏器处理及病毒的增殖

2.2.2 VP1-VP3 核酸片段克隆

2.2.3 GPV VP1-VP3 核酸重组原核表达载体的构建

2.2.4 VP1-VP3 核酸片段在大肠杆菌的诱导表达

2.2.5 VP1-VP3 核酸片段表达蛋白的亲合层析纯化及鉴定

2.2.6 GPV 核酸检测方法的建立

2.2.7 间接 ELISA 检测 GPV 抗体方法的建立

2.2.8 斑点ELISA 检测GPV 抗体方法的建立

2.2.9 间接ELISA 鉴别GPV 抗体和VP3 亚单位抗体方法的建立

2.2.10 斑点ELISA 鉴别GPV 抗体和VP3 亚单位抗体方法的建立

2.2.11 GPV 中和试验

3 结果

3.1 GPV H1 株VP1-VP3 核酸片段的克隆与序列分析

3.2 VP1-VP3 核酸片段重组原核表达载体的构建

3.3 VP1-VP3 核酸片段在大肠杆菌中的表达及产物的纯化鉴定

3.4 GPV DNA 检测方法的建立

3.4.1 GPV DNA PCR 检测方法的建立

3.4.2 DIG 标记核酸探针检测GPV 核酸方法的建立

3.5 检测GPV 抗体方法的建立

3.5.1 间接ELISA 检测GPV 抗体方法的建立及应用

3.5.2 斑点ELISA 检测GPV 抗体方法的建立及应用

3.6 间接ELISA 鉴别GPV 抗体和VP3 亚单位抗体检测方法

3.6.1 间接ELISA 鉴别GPV 抗体和抗VP3 亚单位抗体方法的标准化

3.6.2 间接ELISA 鉴别GPV 抗体与VP3 亚单位抗体检测方法应用

3.7 斑点ELISA鉴别GPV抗体和VP3 亚单位抗体的方法

3.7.1 斑点ELISA鉴别GPV抗体和VP3亚单位抗体方法的标准化

3.7.2 斑点ELISA 鉴别GPV 抗体和VP3 亚单位抗体方法的应用

3.8 病毒中和试验

3.8.1 疫苗毒GPV 的LD50 值测定

3.8.2 中和试验

4 讨论

4.1 PCR 检测GPV 核酸方法的研究

4.2 DIG 标记核酸探针检测 GPV DNA 的研究

4.3 间接ELISA 和斑点ELISA 检测GPV 抗体的研究

4.3.1 候选检测抗原蛋白的表达、分离、复性及纯化

4.3.2 GPV 抗体检测方法的应用及分析

4.4 间接ELISA 及斑点ELISA 鉴别GPV 抗体及VP3 亚单位抗体方法的研究

5 结论

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的论文

发布时间: 2005-10-31

参考文献

[1].肉食动物细小病毒流行株分子特征与致病性分析[D]. 王建科.中国农业科学院2016
[2].狂犬病病毒、细小病毒病毒样粒子及嵌合细小病毒样粒子的构建、鉴定与实验免疫研究[D]. 冯昊.吉林大学2011
[3].水貂肠炎细小病毒致病株的分离及VP2蛋白部分关键氨基酸位点的功能研究[D]. 毛亚萍.中国农业大学2016
[4].鹅细小病毒和番鸭细小病毒部分基因组克隆、序列分析及VP2-VP3基因的表达[D]. 李雪梅.中国人民解放军军需大学2001

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