铅全抗原的制备及铅抗体酶联免疫检测体系的建立

论文摘要

铅是一种具有高蓄积性、多亲和性的生理性和神经性毒物,各国对食品与环境中的铅残留量均有严格的限制。铅抗原与铅抗体的制备是建立铅酶联免疫快速检测试剂盒的基础和关键,本研究运用高度特异性的抗原抗体反应,及免疫竞争结合原理,采用双功能螯合剂将铅与牛血清白蛋白（BSA）桥接合成全抗原免疫Balb/c小鼠,对铅抗体的检测方法进行优化,经细胞融合等步骤制备抗铅单克隆抗体,主要内容如下：1)铅全抗原的制备采用双功能螯合剂[（R）-2-氨基-3-（4-氨基苯基）丙基]-（S-S）环己烷-1,2二乙三胺五乙酸（P-NH2-Bn-Chx-A"-Dtpa）制备重金属铅全抗原,分别用戊二醛法,重氮化法等方法,将螯合剂与牛血清蛋白（BSA）连接,再将合成的蛋白螯合剂复合物与铅离子螯合得到全抗原BSA-P-NH2-Bn-Chx-A"-Dtpa-Pb,其中戊二醛法与重氮化法得到的人工抗原,蛋白与铅的偶联比分别为1：15.64与1：42.95（1：42.95抗原为絮状沉淀物免疫效果不佳）。另外,本研究将戊二醛法予以优化,将戊二醛法制备的蛋白螯合剂复合物与铅离子进行两步合得到抗原BSA-P-NH2-Bn-Chx-A"-Dtpa-Pb,偶联率提高到1：20以上。2)铅抗体ELISA检测方法的建立对间接ELISA检测方法的实验条件进行优化,建立起高效、快捷、方便的铅抗体ELISA检测方法。在初始操作流程的基础上,对缓冲液种类、缓冲液Ph值,抗原包被时间,抗原包被温度,等参数进行优化,确定用Ph=7.4的HBS作为缓冲溶液,包被温度与时间为37℃1h或4℃过夜；通过以上参数的确定,确定铅抗体的ELISA检测体系。3)抗铅单克隆抗体的制备与鉴定将（1）中所制备抗原用于小鼠免疫实验并通过ELISA检验其免疫效果,免疫程序设计上分别做了50μg、100μg两个免疫剂量对照,并适当增加了免疫次数,四免后小鼠效价最高达到1：102400以上,计算不同包被抗原OD值的差异率达128%,证明小鼠体内产生了针对铅的抗体。将阳性小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,融合率达86.04%,单克隆孔率达40.6%,经过5次亚克隆得到两株特异性与敏感性均较好的细胞株15E8、20C11,并通过体内诱生法得到的腹水型单抗。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 重金属铅概述
• 1.2 食品与环境中重金属铅残留的现状
• 1.2.1 环境与食品中重金属铅污染现状
• 1.2.2 重金属铅残留的危害
• 1.2.3 国内外对重金属铅残留的管理
• 1.3 国内外检测铅残留方法研究的现状
• 1.3.1 化学分析方法主要指二硫腙比色法
• 1.3.2 光谱分析法
• 1.3.3 电化学分析法及其他
• 1.3.4 铅免疫学检测方法
• 1.4 重金属铅全抗原的合成概述
• 1.4.1 铅人工抗原合成的重要试剂
• 1.4.2 铅人工抗原的合成常用方法
• 1.5 单克隆抗体的制备
• 1.6 选题意义
• 1.7 主要研究内容
• 第2章 重金属铅全抗原的合成及鉴定
• 2.1 概述
• 2.2 实验试剂与器材
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要仪器与材料
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 铅全抗原的合成
• 2.3.2 铅全抗原偶联比的初步测定
• 2.3.3 铅全抗原的鉴定
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 人工抗原物理状态的比较
• 2.4.2 铅全抗原偶联率的初步测定
• 2.4.3 紫外光谱扫描结果
• 2.4.4 SDS-PAGE电泳法对铅人工抗原的鉴定
• 2.5 讨论
• 2.5.1 全抗原合成
• 2.5.2 全抗原鉴定
• 2.5.3 全抗原偶联比
• 2.6 本章小结
• 第3章 铅抗体ELISA检测方法的建立
• 3.1 概述
• 3.2 实验试剂与器材
• 3.2.1 主要试剂
• 3.2.2 主要仪器与材料
• 3.2.3 主要试剂的配置
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 初始操作流程的确立
• 3.3.2 缓冲液的选择与Ph的确定
• 3.3.3 包被抗原的选择
• 3.3.4 抗原包被温度和时间的确定
• 3.3.5 显色液的选择
• 3.3.6 间接ELISA操作程序的确定
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 初始操作流程的确立
• 3.4.2 缓冲液的选择与Ph的确定
• 3.4.3 包被抗原的验证
• 3.4.4 抗原包被温度和时间的确定
• 3.4.5 显色液的选择
• 3.4.6 间接ELISA操作程序的确定
• 3.5 本章小结
• 第4章 抗铅单克隆抗体的制备与鉴定
• 4.1 概述
• 4.2 试验材料
• 4.2.1 试验试剂
• 4.2.2 主要材料和仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 试剂的配制
• 4.3.2 动物免疫及免疫效果鉴定
• 4.3.3 细胞融合
• 4.3.4 细胞的选择性培养和杂交瘤细胞株的筛选
• 4.3.5 杂交瘤细胞的扩大培养和冻存
• 4.3.6 杂交瘤细胞培养上清液抗体效价与特异性测定
• 4.3.7 腹水单抗的制备与纯化
• 4.4 实验结果与讨论
• 4.4.1 免疫效果鉴定结果
• 4.4.2 细胞融合结果
• 4.4.3 腹水效价测定
• 4.5 讨论
• 4.5.1 不同偶联比的免疫抗原对小鼠免疫效果的影响
• 4.5.2 细胞融合
• 4.5.3 细胞株的筛选
• 4.6 本章小结
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间的研究成果