基于基因组分析的VC发酵混菌体系共生机制及功能强化

论文摘要

剖析Ketogulonigenium vulgare及其伴生菌Bacillus sp.相互作用机制并对混菌体系进行调控，及构建高产维生素C前体的菌株，是优化维生素C工业生产的两个重要方面。本文对该混菌体系中的产酸菌株和伴生菌株进行基因组水平系统分析，探究两菌形成共生关系的遗传背景和代谢互作机制；构建产古龙酸途径及其辅因子吡咯喹啉醌（PQQ）合成的功能模块，通过功能模块之间最优组合及其与底盘细胞之间的适应性进化，强化混菌体系的发酵水平。采用高通量测序技术获得实验室产酸菌K. vulgare HB602全基因组序列和工业伴生菌Bacillus endophyticus Hbe603的基因组框架序列。通过基因组分析，K.vulgare的共生特性有赖于编码了分解、吸收并利用伴生菌提供的蛋白类、肽类和氨基酸类物质的强大系统，响应环境变化的转录调控蛋白及趋化调控系统。其高效的山梨糖转化能力与基因组中5拷贝的山梨糖脱氢酶基因和2拷贝的山梨酮脱氢酶基因相关。伴生菌基因组编码完整的芽孢形成途径，但缺失大量芽孢衣合成基因及rap-phr信号系统，具有独特的芽孢衣外层结构和起始芽孢形成的调控机制，与其作为优良伴生菌的特性相关。利用K. vulgare及伴生菌B. megaterium的全基因组数据构建基因组水平代谢网络，发现产酸菌在碳水化合物、脂和辅因子/维生素代谢途径中所包含代谢反应的比例低于伴生菌，是其生长缓慢的主要原因；伴生菌可能通过弥补其在半乳糖代谢、丁酸代谢、脂肪酸分解、谷氨酸合成、甲硫氨酸循环、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸降解、尿素循环、色氨酸代谢、辅因子/维生素合成等途径中的代谢缺陷形成代谢互补关系，构成稳定的共生体系。对混菌体系产古龙酸途径进行功能强化，构建三种产酸能力不同的产酸模块和三种产PQQ水平不同的辅因子合成模块，将两类模块进行搭配组合获得九种组合模块，并发现在K. vulgare HB602中最适配的组合形式ss-pqqABCDEN，可提高混菌体系产古龙酸水平20%（79.1±0.6g/L）。通过在营养条件下50次混菌转接传代的适应性进化，强化了组合模块在工业菌株K. vulgare HKv604中的功能，其中sdh-pqqABCDEN模块和ss-pqqABCDEN模块在工业底盘细胞内发酵水平提高最为显著，混菌产古龙酸浓度达到79.47±0.00g/L和80.48±0.55g/L。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 维生素 C 工业生产的研究现状和挑战
• 1.1.1 维生素 C 发酵中混菌体系的优势及复杂性
• 1.1.2 优化混菌共生关系的发酵工艺调控和菌株筛选
• 1.1.3 维生素 C 或其前体合成途径的代谢工程改造
• 1.1.4 辅因子优化及目前研究存在的局限
• 1.2 基因组水平研究在解析共生关系中的应用
• 1.2.1 高通量测序在研究微生物共生关系中的应用
• 1.2.2 基因组尺度代谢网络分析在研究共生关系的应用
• 1.3 强化生产菌株核心功能的工程化手段
• 1.3.1 代谢途径的功能强化及辅因子平衡
• 1.3.2 底盘细胞的优化与适应性进化
• 1.4 合成生物学在构建微生物混菌体系中的应用
• 1.5 本课题的研究意义和主要内容
• 1.5.1 本课题的研究意义
• 1.5.2 本课题的主要内容
• 第二章 实验材料与方法
• 2.1 发酵实验材料和分析方法
• 2.1.1 主要仪器
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 发酵所用菌种及来源
• 2.1.4 培养基配方及溶液的配制
• 2.1.5 培养条件
• 2.1.6 菌体生长检测
• 2.1.7 发酵液中山梨糖、古龙酸的测定
• 2.1.8 发酵液中 PQQ 的测定
• 2.2 基因组测序及分析方法
• 2.2.1 主要仪器
• 2.2.2 主要试剂
• 2.2.3 溶液的配制
• 2.2.4 K. vulgare 基因组的提取
• 2.2.5 B. endophyticus 基因组的提取
• 2.2.6 基因组提取的质控
• 2.2.7 生物信息分析软件
• 2.3 代谢网络构建及代谢物分析方法
• 2.3.1 主要仪器
• 2.3.2 主要试剂
• 2.3.3 代谢网络构建主要流程和软件
• 2.3.4 代谢物测定
• 2.4 K. vulgare 菌株改造材料及实验方法
• 2.4.1 主要仪器
• 2.4.2 主要试剂
• 2.4.3 菌种、质粒和培养基配制
• 2.4.4 DNA 扩增和回收
• 2.4.5 DNA 酶切和连接
• 2.4.6 K. vulgare 感受态细胞的制备和电转化
• 第三章 实验室产酸菌共生特性及调控机制的基因组研究
• 3.1 基因组基本特征及基因预测
• 3.2 COG 功能分类及比较
• 3.3 与共生相关功能基因注释及分析
• 3.3.1 降解能力相关基因
• 3.3.2 转运系统相关基因
• 3.3.3 转录调控系统相关基因
• 3.3.4 趋化性及运动相关基因
• 3.4 产古龙酸途径及其辅因子合成途径的模块抽提
• 3.5 密码子使用频率的特点
• 3.6 小结
• 第四章 工业伴生菌共生机制的基因组研究和比较分析
• 4.1 基因组序列的拼接与组装
• 4.2 基因组基本特征及基因预测
• 4.3 种属关系的确定
• 4.4 COG 功能分类及比较
• 4.5 共生相关基因功能注释及与近缘菌株比较分析
• 4.5.1 芽孢产生过程相关基因
• 4.5.2 自然感受态相关基因
• 4.5.3 转录调控相关基因
• 4.5.4 环境耐受相关基因
• 4.6 小结
• 第五章 产酸菌与伴生菌代谢互补机制的网络分析和比较
• 5.1 产酸菌代谢网络的初步构建
• 5.2 伴生菌代谢网络的初步构建
• 5.3 两菌代谢途径的差异和互补性
• 5.4 两菌代谢网络拓扑结构的差异和互补性
• 5.5 两菌胞内代谢物的差异及共生作用对其影响
• 5.6 两菌间代谢互作的共生关系推测
• 5.7 小结
• 第六章 混菌体系古龙酸生产途径的功能强化
• 6.1 山梨糖转化关键酶的过表达及影响
• 6.1.1 山梨糖脱氢酶与山梨酮脱氢酶的模块化
• 6.1.2 产酸模块对单菌生长与产酸的影响
• 6.1.3 产酸模块对混菌体系发酵特性的影响
• 6.1.4 含产酸模块的混菌体系对辅因子的需要
• 6.2 辅因子合成途径的不同水平过表达
• 6.2.1 辅因子吡咯喹啉醌合成的模块化
• 6.2.2 不同辅因子合成模块对辅因子合成量及产酸量的影响
• 6.3 产酸模块与辅因子合成模块间的组合优化
• 6.3.1 模块组合的设计和构建
• 6.3.2 不同组合模块对单菌及混菌产酸量的影响
• 6.4 小结
• 第七章 工程化混菌体系在不同条件下的适应性进化
• 7.1 组合模块在实验室混菌系统中的传代研究
• 7.1.1 高浓度山梨糖对产古龙酸水平的影响
• 7.1.2 逐渐提高山梨糖浓度下的混菌适应性进化
• 7.1.3 经高糖条件传代后菌株发酵水平的变化
• 7.2 组合模块在工业混菌体系中的适应性进化
• 7.2.1 含组合模块的工业菌株发酵水平
• 7.2.2 营养培养条件下的工业混菌的传代培养
• 7.2.3 适应性进化后工业菌株的发酵水平
• 7.3 小结
• 第八章 结论与展望
• 8.1 结论
• 8.2 创新点
• 8.3 展望
• 参考文献
• 发表论文和参加科研情况说明
• 附录
• 致谢