6-BA和氮素调控小麦、棉花叶片衰老的生理机制及衰老相关基因鉴定

论文摘要

早衰是生产中经常发生的限制作物光合潜力、产量和品质的重要因素之一。深刻揭示与早衰相关的植物衰老的生理和分子机制,对于进一步提高作物的光合生产力具有重要的理论价值和实践意义。本项研究在前人基础上,研究了细胞分裂素类物质（6-苄基嘌呤,6-BA）和氮素调控小麦、棉花叶片衰老的生理机制,采用现代分子生物学技术,对小麦和棉花叶片自然衰老以及6-BA和氮素调控过程中的特异表达基因进行了鉴定。采用基因克隆、表达和遗传转化技术,开展了可能与小麦衰老和抗逆相关的超氧化物歧化酶（SOD）新型基因的克隆和功能研究。主要研究结果如下:1.对6-BA调控小麦叶片衰老特征及其生理机制研究表明,与对照相比,喷施外源6-BA能维持小麦叶片衰老期间较高的叶绿素含量,增加叶片衰老后期的过氧化氢酶（CAT）活性,降低细胞的膜脂过氧化程度。上述机制是外源6-BA延缓植株和叶片衰老的重要生理原因。生产中,应根据小麦的熟期和叶片衰老特征,合理施用外源细胞分裂素类物质的浓度和数量。2.低氮处理小麦株高、单株叶面积、鲜重和干重均有不同程度的降低。叶绿素a、b、光合速率、可溶性糖和可溶性蛋白含量均明显降低。不同供氮水平对细胞膜质过氧化和叶片衰老程度的细胞保护酶的调控,主要是通过SOD活性和过氧化物酶（POD）活性共同调控完成的,CAT活性的调控效应较小。研究表明,低氮处理中糖、氮代谢减慢,可能是叶片结构和功能遭到破坏,进而造成叶片衰老加快的主要原因之一。3.采用cDNA-AFLP技术,在小麦自然衰老15 d、30 d和45 d中,分别鉴定了9、20和16个特异上调表达基因;以及13、8和4个特异下调表达基因。利用生物信息学技术,对上述基因的比对和功能分组表明,上调基因归属于细胞代谢、蛋白质合成、信号转导、细胞防御和保护4个类别;下调基因归属于细胞代谢、信号转导、细胞防御和保护3个类别。6-BA处理后15 d和30 d,分别鉴定了13个和8个上调特异基因,2个和4个下调特异表达基因。上述基因分别归属于细胞代谢、蛋白质合成、信号转导和细胞防御和保护4个类别。低氮处理15 d后,分别鉴定了与对照相比特异上、下调特异表达基因为13个和4个,归属于细胞代谢、转录、蛋白质合成、信号转导、细胞防御和保护5个类别。结果表明,在小麦的自然衰老过程,以及外源6-BA和低氮处理调控的叶片衰老过程中,存在着复杂的基因调控网络和代谢途径,小麦叶片衰老是通过信号转导调控的多条代谢途径共同作用的结果。4.与对照（CK）相比,外源6-BA增加了棉花的株高、主茎出生叶数、单株叶面积和单株干重。6-BA对叶绿素含量、可溶蛋白含量和光合速率也有一定的促进作用,但以对易衰型品种33B的促进效应较大,延衰型品种丰抗6的促进效应较小。6-BA处理使SOD活性和POD活性增加,丙二醛（MDA）含量降低。6-BA改善了叶片生长中后期活性氧产生和清除之间的平衡能力,可能是改善叶片光合、植株生长和延缓叶片衰老的重要内在原因。外源施用6-BA,对于延缓生产中易衰型棉花品种的衰老可能具有重要作用。5.以易衰型品种33B和延衰型品种丰抗6为材料,研究了不同氮素水平对棉花光合和衰老特性的影响。研究表明,在不同氮素水平下丰抗6的光合速率（Pn）均明显高于33B。随着处理时间延长,不同氮素处理下33B和丰抗6的叶绿素a、b含量、类胡萝卜素含量和可溶蛋白含量均不断下降,其中,在低氮下,处理中后期丰抗6的上述参数高于33B。低氮处理下,与33B相比,丰抗6处理中后期具有较高的SOD活性。不同氮素处理中,丰抗6的MDA含量低于33B,而单株干重和单株叶面积则高于33B。较低的细胞膜质过氧化程度可能是延衰型品种丰抗6在不同氮素水平下衰老缓慢的重要生理基础。6.利用cDNA-AFLP技术,鉴定棉花叶片自然衰老15 d和30 d与叶片全展（展后0 d）相比的特异表达基因。其中特异上调表达基因为13个和22个,下调表达基因均为6个。分别归属于细胞代谢、转录、蛋白质合成、蛋白质命运、信号转导和细胞防御和保护等6个类别。分析发现,衰老信号通过诱发Ca2+信号及其级联传递,可能介导了棉花叶片的自然衰老进程。6-BA处理后,在叶片衰老期间15 d和30 d分别鉴定了12个和6个上调表达基因,以及5个和14个下调表达基因,分别归属于细胞代谢、转录、蛋白质合成、细胞运输、信号转导、细胞防御和保护及细胞组分再生等7个类别。外源6-BA处理可能通过对生长素信号转导途径的调控,参与了对棉花叶片的衰老调控。本研究中,在低氮处理后15 d和30 d鉴定的特异上调表达基因分别为16个和10个,下调表达基因分别为4个和20个。7.依据在NCBI基因库中发布的小麦CuZnSOD基因SOD1.1的碱基序列,克隆了2个可能在植物抗逆和延缓衰老中具有重要功能的小麦新型SOD基因TaSOD1.1和TaSOD1.2。研究表明,TaSOD1.1和TaSOD1.2的全长cDNA序列分别为980 bp和1121bp,均编码201个氨基酸。编码蛋白质中含有一个79个氨基酸残基组成的CuZn-SOD保守域和一个由45个氨基酸残基组成的位于N-端的转运肽。研究发现,在叶片自然老化过程中,TaSOD1.1和TaSOD1.2的表达水平没有改变;在干旱、盐分、低温和高温逆境条件下,TaSOD1.1的表达水平也无变化;但TaSOD1.2的表达受到上述逆境的诱导。且TaSOD1.2在逆境下诱导表达水平的增加幅度与同期叶片SOD活性的增高幅度相一致。表明上述逆境信号通过转导对TaSOD1.2基因进行了转录调节。8.对超表达TaSOD1.1和TaSOD1.2的烟草转基因系的延衰和抗逆功能研究表明,超表达上述基因的转基因系,叶片衰老与对照相比没有明显的延缓。但超表达TaSOD1.1和TaSOD1.2的转基因烟草,在盐分和低温胁迫条件下,植株通过外源TaSOD1.1和TaSOD1.2基因在转录和翻译水平上的调节,能明显缓解NaCl和低温对植株的伤害作用。与对照相比,转基因植株的叶绿素a、b和类胡萝卜素含量、可溶性糖含量和可溶性蛋白含量均明显增加,细胞膜质过氧化产物MDA的数量明显减少。表明TaSOD1.1和TaSOD1.2在作物抗盐和低温的遗传工程中,可能具有重要的应用前景。

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摘要

Abstract

引言

1 植物衰老假说及其环境调控效应

1.1 植物衰老假说

1.2 环境因子对植物叶片衰老的影响

2 植物衰老时的生理生化特征

2.1 蛋白质和核酸含量显著下降

2.2 细胞保护酶活性和膜脂过氧化程度的变化

2.3 光合和呼吸功能衰退

2.4 激素变化

3 植物叶片衰老的分子基础

3.1 植物衰老相关基因的克隆和鉴定

3.2 衰老相关基因的功能类别

3.3 植物叶片衰老相关基因的表达特性

3.4 叶片衰老基因的表达调控

3.5 叶片衰老的分子操作

4 本项研究的目的和意义

第一章 6-BA调控小麦叶片衰老的生理机制

1.1 材料和方法

1.1.1 材料培养

1.1.2 测定方法

1.2 结果与分析

1.2.1 6-BA对株高、单株叶面积、鲜干重的影响

1.2.2 6-BA对叶绿素a和叶绿素b含量的影响

1.2.3 6-BA对气孔导度、光合速率、可溶蛋白含量和可溶性糖含量的影响

1.2.4 6-BA对活性氧清除酶活性和丙二醛（MDA）含量的影响

1.2.5 6-BA对处理后期下位叶生理参数、活性氧清除酶活性和丙二醛的影响

1.3 讨论

1.3.1 6-A对细胞分裂和干物质积累能力的调控效应不同

1.3.2 6-BA调控光合碳同化的生理机制

1.3.3 过氧化氢酶（CAT）活性在6-BA调控的活性氧清除中具有重要作用

1.3.4 不同衰老类型品种耐受6-BA的程度存在较明显差异

第二章氮素调控小麦叶片衰老的生理机制

2.1 材料和方法

2.2 结果与分析

2.2.1 氮素处理对植株形态及鲜干重的影响

2.2.2 氮素处理对叶片叶绿素含量的影响

2.2.3 氮素处理对叶片光合速率、可溶性蛋白和可溶性糖含量的影响

2.2.4 氮素处理对小麦叶片SOD活性和POD活性的影响

2.2.5 氮素处理对叶片过氧化氢酶活性和丙二醛含量的影响

2.3 讨论

2.3.1 低氮胁迫对不同熟性小麦叶片衰老和光合能力的调控效应

2.3.2 低氮胁迫对小麦细胞保护酶活性和膜质过氧化特性的影响

第三章叶片自然衰老及6-BA和氮素调控小麦衰老的特异表达基因鉴定

3.1 材料和方法

3.1.1 材料培养

3.1.2 cDNA-AFLP过程

3.1.3 cDNA-AFLP产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显影

3.1.4 差异条带DNA回收和克隆

3.1.5 差异条带DNA阳性克隆的序列测定

3.1.6 差异表达序列的生物信息学分析

3.2 结果与分析

3.2.1 总RNA和合成的双链cDNA检测

3.2.2 cDNA-AFLP结果

3.2.3 特异表达基因片段的的克隆

3.2.4 小麦叶片自然衰老过程中的特异表达基因和可能的功能分析

3.2.5 6-BA调控小麦衰老过程中的特异表达基因和可能的功能分析

3.2.6 低氮处理调控小麦衰老过程中的特异表达基因和可能的功能分析

3.2.7 叶片自然衰老、6-BA和低氮处理特异表达基因的分布特征

3.3 讨论

3.3.1 cDNA-AFLP技术及其在本研究中鉴定的特异表达基因的特征分析

3.3.2 叶片自然衰老过程、6-BA和低氮调控的叶片衰老相关基因的类别

3.3.3 叶片自然衰老过程、6-BA和低氮胁迫调控的叶片衰老进程中存在着复杂的调控网络

第四章 6-BA调控棉花叶片衰老的生理机制

4.1 材料和方法

4.2 结果与分析

4.2.1 6-BA处理对株高和主茎出生叶数的影响

4.2.2 6-BA处理对单株叶面积和单株干重的影响

4.2.3 6-BA处理对叶绿素含量、可溶蛋白含量和光合速率的影响

4.2.4 6-BA处理对活性氧清除酶活性和丙二醛含量的影响

4.3 讨论

第五章氮素调控棉花叶片衰老的生理机制

5.1 材料和方法

5.2 结果与分析

5.2.1 氮素对叶片光合速率的影响

5.2.2 氮素对叶片叶绿素含量和类胡萝卜素含量的影响

5.2.3 氮素对叶片可溶蛋白含量和可溶性糖含量的影响

5.2.4 氮素对细胞保护酶 SOD活性、POD活性和丙二醛含量的影响

5.2.5 氮素对单株干重和单株叶面积的影响

5.3 讨论

第六章叶片自然衰老及6-BA和氮素调控棉花衰老的特异表达基因的鉴定

6.1 材料和方法

6.1.1 材料培养

6.1.2 棉花叶片总RNA的提取

6.2 结果与分析

6.2.1 总RNA和合成的双链cDNA检测

6.2.2 cDNA-AFLP结果

6.2.3 特异表达基因片段的克隆

6.2.4 棉花叶片自然衰老过程中的特异表达基因和可能的功能分析

6.2.5 6-BA调控棉花衰老过程中的特异表达基因和可能的功能分析

6.2.6 低氮处理调控棉花衰老过程中的特异表达基因和可能的功能分析

6.2.7 叶片自然衰老、6-BA和低氮处理特异表达基因的分布特征

6.3 讨论

6.3.1 棉花叶片自然衰老过程中的特异表达基因及其可能功能

6.3.2 6-BA调控棉花叶片衰老过程中的特异表达基因及其可能功能

6.3.3 低氮处理调控棉花叶片衰老过程中的特异表达基因及其可能功能

第七章小麦新型CuZnSOD基因TaSOD1.1和TaSOD1.2的克隆和表达特性研究

7.1 材料和方法

7.1.1 小麦新型CuZnSOD基因TaSOD1.1和TaSOD1.2的鉴定

7.1.2 TaSOD1.1和TaSOD1.2的克隆

7.1.3 TaSOD1.1和TaSOD1.2基因的结构和编码蛋白质特征

7.1.4 TaSOD1.1和TaSOD1.2在干旱、盐分、低温、高温和自然衰老中的表达特性

7.1.5 干旱、盐分、低温、高温处理和叶片自然衰老中的叶片 SOD活性

7.2 结果与分析

7.2.1 小麦新型CuZnSOD基因TaSOD1.1和TaSOD1.2的鉴定和克隆

7.2.2 TaSOD1.1和TaSOD1.2的基因结构和编码蛋白特征

7.2.3 TaSOD1.1和TaSOD1.2在自然衰老过程中和干旱、盐分、低温、高温的表达特性

7.2.4 自然衰老过程中和干旱、盐分、低温、高温处理的叶片SOD活性

7.3 讨论

第八章小麦CuZnSOD基因表达载体构建、遗传转化和功能研究

8.1 材料和方法

8.1.1 材料

8.1.2 融合TaSOD1.1和TaSOD1.2的双元表达载体构建

8.1.3 烟草遗传转化

8.1.4 转基因系PCR鉴定和插入单拷贝靶基因的转基因系筛选

8.1.5 超表达TaSOD1.1和TaSOD1.2对植株和叶片的衰老调控效应

8.1.6 超表达TaSOD1.1和TaSOD1.2对植株抵御盐分胁迫能力的影响

8.1.7 超表达TaSOD1.1和TaSOD1.2对植株抵御低温能力的影响

8.2 结果与分析

8.2.1 遗传转化TaSOD1.1和TaSOD1.2的烟草转基因系建立

8.2.2 TaSOD1.1和TaSOD1.2转基因烟草的分子检测

8.2.3 超表达TaSOD1.1和TaSOD1.2对植株和叶片衰老特性的影响

8.2.4 超表达TaSOD1.1和TaSOD1.2对植株抵御盐分胁迫能力的影响

8.2.5 超表达TaSOD1.1和TaSOD1.2对植株抵御低温能力的影响

8.3 讨论

8.3.1 有关植物种属超氧化物歧化酶（SOD）基因的克隆和功能研究

8.3.2 超表达TaSOD1.1和TaSOD1.2不具有延缓植株叶片衰老的能力

8.3.3 超表达TaSOD1.1和TaSOD1.2增强了植株抵御盐分胁迫的能力

8.3.4 超表达TaSOD1.1和TaSOD1.2增强了植株抵御低温的能力

结论

参考文献

附录

在读期间发表的学术论文

作者简介

致谢

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