转基因植物及产品核酸检测新技术研究

论文摘要

在过去的15年中,转基因作物在全球范围内得到了快速的发展。截至2010年底,商业化转基因作物的种植面积达到1.48亿公顷,比1996年增长了近87倍。由于人们对转基因生物安全性的担心和忧虑,许多国家和地区纷纷出台了包括对转基因生物标签制度在内的管理制度,对转基因产品进行标识和追溯管理。因此,开展转基因植物及其产品检测方法的研究对这些法规的实施十分重要。目前,转基因产品检测主要基于定性和定量PCR方法,由于越来越多转基因产品进入市场,研究自动、快速、高通量的新型检测方法成为国内外转基因产品检测方法研究的热点。本论文围绕新的转基因的作物的内源参照基因、品系特异性检测方法,以及新型的转基因成分核酸高通量筛选、鉴定检测方法展开了一系列研究,并获得了重要的研究成果。1、为建立我国新批准商业化种植的转基因番木瓜“华农1号”转化体特异性检测方法,研究中首先寻找并验证了一个适合于转基因番木瓜检测的内源参照基因Chymopapain （CHY）,建立了其定性和定量PCR检测方法,定性PCR方法中的检测限为25拷贝,定量检测限为12.5个拷贝单倍体番木瓜基因组。随后,利用普通PCR和TAIL-PCR相结合的方法,分析了“华农1号”番木瓜外源插入基因的序列信息,获得了“华农1号”番木瓜外源插入基因的5’端和3’端旁邻序列,并根据其5’端旁邻序列,设计了品系特异性定性、定量PCR引物和探针,建立了品系特异性定性、定量检测方法。定性PCR检测中,检测限可达到25个拷贝的单倍体番木瓜基因组,定量PCR检测中,检测限和定量检测限分别可达到12.5和25个拷贝的番木瓜单倍体基因组DNA分子。对3个浓度水平的转基因番木瓜样品的检测偏差都小于5%,检测结果显示了本研究中建立的番木瓜内源参照基因、以及“华农1号”转基因番木瓜品系特异性检测方法可实际应用于实际样品的检测。2、为建立新型转基因生物筛选检测方法,我们基于目前转基因作物中含有一些常用的、表达相同性状的外源基因序列相似度高的特点,建立了一种4重兼并引物PCR方法筛选检测转基因作物,可同时检测转基因作物中普遍存在的Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A（b/c）、mCry3A、Cry3Bb1、cp4-EPSPS、bar和/或pat基因,筛选检测范围覆盖了目前90多种商业化转基因作物。本方法具有快速、简单、灵敏的特点,其绝对检测限可达到80个拷贝DNA分子,相对于现有的仅针对单一外源基因序列的PCR筛选检测方法适应性更广,检测成本可降低至少50%。3、建立了一种新型高通量DNA分子分析方法:微滴聚合酶链式反应-毛细管凝胶电泳（Microdroplet PCR Implemented Capillary Gel Electrophoresis, MPIC）,该技术包含两步PCR扩增反应和毛细管凝胶电泳分析。第一步,不同目标DNA分子在一个或几个常规复合PCR中进行5-10个循环的预扩增,预扩增的产物两端分别带有一段不同的通用序列标签;第二步,在微滴PCR中,每一个预扩增的模板分子被单独地分配到微小的乳化微滴中,使用通用序列的互补序列作为引物进行平行地、高通量地扩增;第三步,根据目标序列的大小不同,应用毛细管凝胶电泳对微滴PCR的扩增产物进行自动分离检测。本文中优化了MPIC方法反应的体系和条件,评估了该方法的特异性和灵敏度,并在目前广为关注的转基因产品检测领域中应用本方法对样品中转基因成分进行了分析,结果表明可同时对至少24个不同的目标序列进行特异性地检测分析,其检测的灵敏度可达39个目标DNA分子。此方法基本解决了当前高通量检测技术中目标DNA分子扩增通量较低的缺点,比简单的复合PCR扩增方法,扩增目标DNA分子的数量可提高数倍。因此,可作为生物学研究中高通量DNA分子分析的一种手段,对多个DNA分子同时进行检测,提高了分析的通量,节约检测成本。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写一览表
• 第一章 绪论
• 1.1 转基因植物
• 1.2 全球转基因作物商业化种植、应用现状
• 1.3 转基因生物安全性评价和管理
• 1.3.1 主要国际组织对于转基因生物的安全管理
• 1.3.1.1 国际食品法典委员会 （CAC）
• 1.3.1.2 经济发展合作组织 （OECD）
• 1.3.1.3 国际作物生命协会 （CropLife International）
• 1.3.1.4 国际标准化组织 （ISO）
• 1.3.2 主要国家对转基因生物的安全管理
• 1.3.2.1 欧盟
• 1.3.2.2 美国
• 1.3.2.3 日本
• 1.3.2.4 中国
• 1.4 转基因及其产品检测方法
• 1.4.1 基于蛋白质的检测技术
• 1.4.2 基于核酸的DNA 扩增、产物检测技术
• 1.4.2.1 植物基因组DNA 提取和纯化
• 1.4.2.2 基因组DNA 浓度测定和评价
• 1.4.2.3 植物基因组DNA 质量和拷贝数换算
• 1.4.2.4 内标准基因和阳性参考物质
• 1.4.2.5 定性PCR 检测方法
• 1.4.2.6 定量PCR 检测方法
• 1.4.2.6.1 竞争性定量PCR
• 1.4.2.6.2 实时荧光定量PCR
• 1.4.2.7 核酸等温扩增技术
• 1.4.2.8 DNA 芯片或DNA 微阵列 （DNA Microarrays） 技术
• 1.4.2.9 生物传感器 （Biosensors）
• 1.4.3 转基因植物检测技术标准化
• 1.4.4 转基因产品检测方法数据库
• 1.4.5 未批准转基因植物检测
• 1.4.6 转基因植物及产品检测方法发展趋势及展望
• 1.5 本课题研究的目的、内容和意义
• 第二章 番木瓜内源参照基因及“华农1 号”转基因番木瓜品系特异性检测方法研究
• 2.1 实验材料、试剂与仪器
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 常用试剂
• 2.1.3 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 植物基因组DNA 提取和纯化
• 2.2.2 基因组DNA 浓度测定和评价
• 2.2.3 番木瓜内源参照基因检测方法建立
• 2.2.3.1 番木瓜内源参照基因的查找
• 2.2.3.2 番木瓜内源参照基因定性、定量PCR 引物设计
• 2.2.3.3 CHY 基因定性PCR 反应体系和条件
• 2.2.3.4 CHY 基因定量PCR 反应体系和条件
• 2.2.3.5 CHY 内源参照基因的PCR 验证
• 2.2.3.5.1 CHY 内源参照基因种内非特异性验证
• 2.2.3.5.2 CHY 基因种间特异性验证
• 2.2.3.5.3 CHY 基因拷贝数评估
• 2.2.3.6 CHY 基因特异性PCR 检测灵敏度
• 2.2.3.7 CHY 基因在转基因番木瓜检测中的应用
• 2.2.4 “华农1 号”番木瓜品系特异性定性、定量检测方法研究
• 2.2.4.1 “华农1 号”番木瓜外源插入基因及其旁邻序列信息分析
• 2.2.4.2 “华农1 号”番木瓜品系特异性PCR 引物、探针设计
• 2.2.4.3 定性、定量PCR 反应体系和反应条件的建立
• 2.2.4.3.1 定性PCR 反应体系和条件
• 2.2.4.3.2 定量PCR 反应体系和条件
• 2.3. 结果与分析
• 2.3.1 番木瓜内源参照基因检测方法建立
• 2.3.1.1 番木瓜内源参照基因的筛选
• 2.3.1.2 CHY 内源参照基因的验证
• 2.3.1.2.1 CHY 基因种间特异性鉴定
• 2.3.1.2.2 CHY 基因种内非特异性检测
• 2.3.1.2.3 CHY 基因在番木瓜中的拷贝数评估
• 2.3.1.3 CHY 基因测序分析
• 2.3.1.4 CHY 基因定性PCR 的灵敏度
• 2.3.1.5 CHY 基因定量PCR 检测
• 2.3.1.5.1 定量PCR 检测体系的检测极限（LOD） 和定量极限（Limit of Quantitation, LOQ）。
• 2.3.1.5.2 标准曲线构建
• 2.3.1.5.3 定量PCR 检测体系的重复性和重演性
• 2.3.1.6 番木瓜内源参照基因CHY 可应用性检测
• 2.3.2 “华农1 号”番木瓜品系特异性定性、定量检测方法研究
• 2.3.2.1 “华农1 号”番木瓜外源基因表达框的结构和序列信息
• 2.3.2.2 外源整合序列的特征描述
• 2.3.2.3 “华农1 号”番木瓜品系特异性定性PCR 检测方法
• 2.3.2.4 “华农1 号”番木瓜品系特异性定量检测方法
• 2.3.2.4.1 定量PCR 检测体系的LOD 和LOQ
• 2.3.2.4.2 标准曲线构建
• 2.3.2.4.3 品系特异性定量PCR 检测体系的重复性和重演性
• 2.3.2.5 应用建立的品系特异性检测方法对实际转基因番木瓜样品的定量分析
• 2.4 本章小结和讨论
• 第三章 基于复合兼并引物PCR 的转基因作物高通量筛选检测方法研究
• 3.1 实验材料、试剂与仪器
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 常用试剂
• 3.1.3 主要仪器设备
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 植物基因组DNA 提取和纯化
• 3.2.2 基因组DNA 浓度测定和评价
• 3.2.3 DNA 样品制备
• 3.2.4 外源插入基因基因序列分析
• 3.2.5 兼并PCR 引物设计
• 3.2.6 兼并PCR 扩增体系的建立
• 3.2.7 兼并PCR 扩增方法验证
• 3.2.7.1 兼并PCR 扩增方法特异性验证
• 3.2.7.2 兼并PCR 扩增方法灵敏度检测
• 3.2.8 复合兼并PCR 扩增方法检测实际样品
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 外源插入基因基因序列分析
• 3.3.1.1 mCry3A 和Cry3Bb1 基因序列分析
• 3.3.1.2 CP4-EPSPS 基因序列分析
• 3.3.1.3 bar 和pat 基因序列分析
• 3.3.1.4 Cry1Ab、Cry1Ac 和Cry1A（b/c）基因序列分析
• 3.3.2 兼并PCR 扩增方法建立
• 3.3.2.1 兼并PCR 扩增方法特异性验证
• 3.3.2.1.1 mCry3-F/R PCR 反应体系特异性检测
• 3.3.2.1.2 mCP4ES-F/R PCR 反应体系特异性检测
• 3.3.2.1.3 mPAT-F/R PCR 反应体系特异性检测
• 3.3.2.1.4 mCry1A-F/R PCR 反应体系特异性检测
• 3.3.2.1.5 复合兼并引物PCR 方法特异性检测
• 3.3.2.2 兼并PCR 扩增方法灵敏度检测
• 3.3.3 实际样品检测评估4 重复合兼并PCR 扩增方法的可应用性
• 3.4 本章小结和讨论
• 第四章 MPIC：一种新的基于毛细管凝胶电泳检测的微滴聚合酶链式反应分析方法研究
• 4.1 实验材料、试剂与仪器
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 试剂
• 4.1.3 主要仪器设备
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 植物基因组DNA 提取和纯化
• 4.2.2 基因组DNA 浓度测定和评价
• 4.2.3 DNA 样品制备
• 4.2.4 通用引物设计
• 4.2.5 目标特异性引物设计
• 4.2.6 单重PCR 扩增体系和程序
• 4.2.7 MPIC 方法的建立
• 4.2.7.1 复合模板的合成
• 4.2.7.2 微滴制备
• 4.2.7.3 微滴PCR 扩增
• 4.2.7.4 毛细管凝胶电泳检测微滴PCR 产物
• 4.2.8 MPIC 方法的实际应用性检测
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 MPIC 方法的设计和原理
• 4.3.2 MPIC 方法中微滴的热稳定性评估
• 4.3.3 MPIC 方法优化
• 4.3.3.1 DNA 聚合酶的选择
• 4.3.3.2 引物浓度
• 4.3.3.3 纯化/不纯化复合模板对MPIC 方法的影响
• 4.3.3.4 预扩增循环数对MPIC 的影响
• 4.3.4 八重MPIC 方法中PCR 扩增特异性检测
• 4.3.5 八重MPIC 方法方法灵敏度检测
• 4.3.6 MPIC 方法的灵活性
• 4.3.7 实际样品检测评估MPIC 方法的可应用性
• 4.4 本章小结和讨论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读博士学位期间已发表或录用的论文
• 附件