百合再生体系的建立及DREB2A基因的转化

论文摘要

本试验以东方百合‘Siberia’为研究材料,对其鳞片进行了直接再生不定芽系统的建立,同时进行了鳞茎增重,并以其无菌鳞片叶为外植体进行了不定芽诱导。在此基础上以百合无菌鳞片叶为遗传转化受体,通过鳞片直接再生不定芽方式,将逆境启动子DREB2A基因通过农杆菌介导法转入百合,建立了稳定的遗传转化体系,得到了经PCR检测为阳性的植株。本研究的主要结果如下:1.建立了百合鳞片直接再生不定芽体系:以百合离体鳞片为外植体,最适不定芽诱导培养基为MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L,芽诱导率达到85.0%;最适增殖培养基是MS+6-BA0.7 mg/L+NAA0.2 mg/L;最适生根培养基为1/2MS+NAA 0.2 mg/L,生根率为100.0%。2.建立了百合鳞茎的增重体系:鳞茎增重最适培养基为MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.5 mg/L,附加蔗糖量为7%,增殖率达291.7%。同时建立了鳞片叶再生不定芽体系:鳞片叶再生最适培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+2, 4-D 1.0 mg/L,再生率为92.5%;小叶柄再生最适培养基为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L,再生率为83.3%。3.建立了百合遗传转化体系:最佳体系为:以百合鳞片叶为转化受体,预培养时间为2 d,选用YEB菌液,重悬浮时用MS菌液作为浸染液,侵染时菌液浓度为OD600=0.6,侵染时间为15 min,共培养3 d,卡那浓度为125 mg/L,头孢霉素在除菌过程中使用浓度为400 mg/L,直至抗性芽的形成。在共培养时加入乙酰丁香酮可提高转化率,AS浓度为50 mmol/L即可达到最好,同时共培养基中去除NH4NO3可提高转化率。4.抗性植株的PCR检测:获得抗性植株27株,抗性植株率可达15.2%。检测抗性植株,其中3株为阳性植株,PCR阳性率为11.1%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 观赏植物基因工程研究进展
• 1.2 百合基因工程研究概况
• 1.2.1 百合组织培养研究进展
• 1.2.2 转基因百合的研究
• 1.3 DREB 基因的研究
• 1.3.1 DREB 基因有关百合的研究目的和意义
• 1.3.2 DREB 基因的结构特征
• 1.3.3 DREB 转录因子的表达调控
• 1.3.4 DREB 基因国内外研究现状
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 农杆菌菌株和质粒
• 2.1.3 试剂与仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 百合再生体系建立
• 2.2.2 农杆菌介导法的转化
• 2.2.3 抗性植株的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 百合再生体系的建立
• 3.1.1 不同激素浓度对鳞片再生的影响
• 3.1.2 不同激素浓度对不定芽增殖的影响
• 3.1.3 不同激素浓度和糖浓度对鳞茎形成的影响
• 3.1.4 不同激素浓度对鳞片叶再生的影响
• 3.1.5 不同激素浓度对小叶柄再生的影响
• 3.1.6 暗培养对鳞片叶及小叶柄再生的影响
• 3.1.7 不同激素浓度对生根的影响
• 3.2 百合遗传转化体系的建立
• 3.2.1 抗生素敏感性试验
• 3.2.2 不同影响因子对转化的影响
• 3.3 转基因植株的检测
• 4 讨论
• 4.1 转化受体材料的选择
• 4.2 预培养时间对转化率的影响
• 4.3 菌液浓度、侵染时间及共培养时间对转化率的影响
• 4.4 乙酰丁香酮的添加对转化率的影响
• 5 结论
• 参考文献
• 附图
• 在读期间发表的学术论文
• 作者简历
• 致谢