超嗜热菌Aquifex aeolicus亮氨酰-tRNA合成酶和tRNA～（Leu）的相互作用

论文题目: 超嗜热菌Aquifex aeolicus亮氨酰-tRNA合成酶和tRNA～（Leu）的相互作用

论文类型: 博士论文

论文专业: 生物化学与分子生物学

作者: 赵明炜

导师: 王恩多

关键词: 亮氨酰合成酶,氨基酰化反应,编校反应,结构域

文献来源: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）

发表年度: 2005

论文摘要: 亮氨酰-tRNA合成酶（Leucyl-tRNA synthetase, LeuRS）属于第一类氨基酰-tRNA 合成酶（aaRS）的a 亚类在蛋白质生物合成过程中它催化tRNALeu的亮氨酰化古老的超嗜热菌Aquifex aeolicus （A. aeolicus）的亮氨酰-tRNA合成酶（αβ-LeuRS）是目前唯一已知的双亚基亮氨酰-tRNA 合成酶大肠杆菌（E. coli）的亮氨酰-tRNA 合成酶则是单亚基酶在克隆了αβ-LeuRS 的α和β亚基的基因以及与之相对应的编码E. coli LeuRS α’和β’亚基的基因片段的基础上通过对应基因片段的不同排列和重组得到了10种来源于大肠杆菌和超嗜热菌的重组LeuRS 基因成功地表达了它们并纯化了其中7 种重组酶通过对重组酶的性质研究发现αβ-LeuRS 的α亚基C 末端36 个氨基酸对于αβ-LeuRS 的氨基酰化活力至关重要αβ-LeuRS 的两个亚基人为融合得到的单亚基酶SLeuRSαβ具有完全的野生型双亚基酶活力它的热稳定性显著增强同时通过亚基重组揭示了LeuRS 对于不同种属的tRNALeu的识别元件位于α亚基内

论文目录:

摘要超嗜热菌Aquifex aeolicus 亮氨酰-tRNA 合成酶和tRNALeu的相互作用

ABSTRACT The interaction between Aquifex aeolicus leucyl-tRNA synthetase and tRNALeu

第一部分亮氨酰-tRNA 合成酶亚基功能与结构基础关系的研究

第一章来源于大肠杆菌和超嗜热菌重组亮氨酰-tRNA合成酶的性质研究

摘要

关键词

1. 引言

2. 材料与方法

2.1 材料

2.2 质粒

2.3 DNA 片段扩增以及含有LeuRS 突变基因的质粒的构建

2.4 重组LeuRS 基因的表达以及重组LeuRS 的纯化

2.5 圆二色性(CD)光谱的测定

2.6 重组LeuRS 氨基酸活化反应动力学常数的测定

2.7 重组LeuRS 氨基酰化反应动力学常数的测定

2.8 SLeuRSαβ亮氨酰化活性位点滴定

2.9 SLeuRSαβ最适反应温度以及热稳定性测定

3. 结果

3.1 重组质粒的构建酶基因的表达与酶的纯化

3.2 LeuRS 突变酶CD 光谱测定结果

3.3 LeuRS 突变酶活力变化

3.4 SLeuRSαβ变种只有一个氨基酰化活性位点

3.5 SLeuRSαβ突变酶稳态动力学性质

3.6 SLeuRSαβ突变酶活力温度关系以及热稳定性

4. 讨论

参考文献

第二章亮氨酰-tRNA 合成酶 CP1 结构域对于种属间tRNALeu的识别至关重要

摘要

关键词

1. 引言

2. 材料和方法

2.1 材料

2.2 DNA 片段的扩增以及含有LeuRS 突变基因的质粒的构建

2.3 LeuRS 突变酶基因的表达以及LeuRS 嵌合酶的纯化

2.4 圆二色性(CD) 光谱的测定

2.5 LeuRS 嵌合酶氨基酸活化反应活力及动力学常数测定

2.6 LeuRS 嵌合酶的氨基酰化反应活力及动力学常数的测定

2.7 LeuRS 嵌合酶误氨基酰化反应的测定

2.8 LeuRS 嵌合酶编校反应ATP 消耗的测定

2.9 同位素标记的误氨基酰化产物的制备和去氨基酰化

3. 结果

3.1 重组质粒的构建酶基因的表达与酶的纯化

3.2 LeuRS 嵌合酶CD 光谱测定结果(51)

3.3 LeuRS 嵌合酶活力变化

3.4 LeuRS 嵌合酶对对应氨基酸和非对应氨基酸的识别

3.5 嵌合酶氨基酰化反应稳态动力学性质

3.6 LeuRS 嵌合酶误氨基酰化反应

3.7 LeuRS 嵌合酶编校反应ATP 消耗

3.8 LeuRS 嵌合酶对误氨基酰化产物的编校

4. 讨论

参考文献

第二部分超嗜热菌亮氨酰-tRNA 合成酶编校功能的研究

第三章超嗜热菌亮氨酰-tRNA 合成酶编校功能的研究

摘要

关键词

1. 引言

2. 材料和方法

2.1 材料

2.2 LeuRS 突变体基因的构建表达以及突变体LeuRS 的纯化

2.3 圆二色性(CD) 光谱的测定

2.4 LeuRS 突变酶的氨基酸活化反应动力学常数测定

2.5 LeuRS 突变酶氨基酰化反应活力及动力学常数的测定

2.6 LeuRS 突变酶误氨基酰化反应的测定

2.7 LeuRS 突变酶编校反应ATP 消耗的测定

2.8 LeuRS 突变酶体内补偿实验

3. 结果

3.1 LeuRS 突变位点的选择与构建

3.2 LeuRS 突变酶基因的表达与酶的纯化

3.3 LeuRS 突变酶CD 光谱测定结果

3.4 LeuRS 突变酶的活力变化

3.5 LeuRS 突变酶对对应和非对应氨基酸的识别

3.6 LeuRS 突变酶的氨基酰化反应稳态动力学性质

3.7 LeuRS 突变酶误氨基酰化反应

3.8 LeuRS 突变酶编校反应ATP 消耗

3.9 不同LeuRS 突变酶对温度敏感菌株KL231 的拯救

4. 讨论

参考文献

第四章超嗜热菌 Aquifex aeolicus 亮氨酰-tRNA 合成酶CP1 结构域独立行使编校功能

摘要

关键词

1. 引言

2. 材料和方法

2.1 材料

2.2 DNA 片段扩增以及含有不同CP1 基因的质粒的构建

2.3 CP1 基因的表达以及不同CP1 结构域的纯化

2.4 圆二色性(CD) 光谱的测定

2.5 RNA 转录产物的制备

2.6 同位素标记的误氨基酰化产物的制备

2.7 CP1 结构域的编校功能及动力学常数的测定

3. 结果

3.1 不同CP1 结构域以及突变体的设计和构建

3.2 重组质粒的构建 CP1 基因的表达与CP1 结构域的纯化

3.3 CP1 结构域及突变体CD 光谱测定结果

3.4 同位素标记的误氨基酰化产物

3.5 只有Aa-CP1 能够对Ile-tRNALeu行使编校功能

3.6 A.a eolicus LeuRS 的β亚基能够赋予独立的E. coli CP1 结构域编校功能

3.7 Aa-CP1 中20-aa 模体对于CP1 结构域编校Ile-tRNA~(Leu)至关重要

3.8 细菌来源的CP1 结构域均能编校Ile-minihelix~(Leu)

3.9 20-aa 模体增强CP1 对小螺旋的编校能力

4. 讨论

参考文献

结论

附录本论文缩写汇编

在学期间论文发表会议报告和获奖目录

致谢

发布时间: 2005-09-09

参考文献

[1].亮氨酰-tRNA合成酶和tRNA～（Leu）的相互作用[D]. 徐敏刚.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）2004
[2].Ic类氨酰tRNA合成酶对tRNA的种属特异性识别[D]. 贾捷.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）2004
[3].精氨酰-tRNA合成酶和tRNA～（Arg）的相互作用[D]. 李娟.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）2005
[4].人色氨酰-tRNA合成酶和人脑组织中丰富表达的Ras同源类似物的结构与功能的研究[D]. 俞亚东.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）2005
[5].超嗜热菌亮氨酰-tRNA合成酶的高表达和一步纯化氨基酰-tRNA合成酶复合物结构和功能的研究[D]. 凌晨.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）2006
[6].人线粒体亮氨酸tRNA结构和功能的研究超嗜热菌亮氨酰-tRNA合成酶双亚基的体外重组[D]. 郝睿.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）2006
[7].一种新的哺乳动物蛋白质合成校正机制HDTD的初步研究[D]. 阳洪波.中国协和医科大学2004
[8].色氨酰-tRNA合成酶结构与功能的研究[D]. 陈祥龙.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）2007
[9].亮氨酰-tRNA合成酶编校功能进化和机制的研究[D]. 朱斌.中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）2007
[10].组蛋白磷酸化和tRNA甲基化相关蛋白的结构与功能研究[D]. 邵振华.中国科学技术大学2014

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