论文摘要
研究背景:胶质母细胞瘤（Glioblastoma Multiforme,GBM）是成人中枢神经系统最常见的原发性恶性肿瘤,占恶性胶质瘤的80%,它是胶质瘤恶性度最高的类型。目前胶质母细胞瘤的主要治疗手段是手术治疗,术后辅以放射治疗和化学药物治疗。虽然在具体方法上有了不少改进,但总体疗效并没有获得明显的改善,胶质母细胞瘤的平均生存率仍然不足1年。另外,肿瘤的复发是胶质瘤面临的最大的问题。所以,需要更加有效治疗的手段来改变胶质瘤治疗的现状。信号转导与转录激活因子（Signal Transducers and Activators of Transcription,STAT）是细胞因子/生长因子信号传导中重要的胞质转录因子,特别是STAT3在调节细胞生长、生存、分化和凋亡中发挥着重要作用。研究发现,STAT3在包括胶质母细胞瘤在内多种恶性肿瘤中表现为持续酪氨酸磷酸化的活性状态。STAT3的过度活化使下游靶基因表达失调,从而使细胞生长失控,抑制肿瘤细胞的凋亡,促进肿瘤细胞的增殖,诱导肿瘤血管生成,参与肿瘤免疫逃逸,抑制免疫功能,最终导致恶性肿瘤的发生和发展。因此,STAT3可成为胶质母细胞瘤治疗的具有吸引力的潜在靶点。目前有多种用于阻断STAT3的方法,其中包括反义核苷酸、核苷酸酶、异位表达显性失活突变体、RNA干扰技术、抑制上游激酶、磷酸酪氨酰缩氨酸和诱骗寡核苷酸等。从葫芦科和十字科植物中提取的天然三萜类化合物JSI-124,是一种选择性JAK/STAT3抑制剂,即不抑制其他信号分子,如ERK或JNK。JSI-124具有很好穿透细胞膜和酪氨酸激酶抑制的功能。研究已证明,JSI-124能够非常直接、有效的抑制STAT3磷酸化水平,阻断JAK/STAT3信号转导,从而调控转录、改变下游靶基因的异常表达,抑制肿瘤恶性增殖。已有报道,JSI-124在体内外治疗人肺腺癌细胞A549和乳腺癌细胞MDA-MB-231中显示出极好的疗效,这提示了JSI-124在恶性脑胶质瘤基因治疗中的应用潜力。本课题旨在研究应用JSI-124靶向性阻断STAT3信号通路,抑制人脑胶质母细胞瘤细胞增殖的效应和机制。研究内容分为两个部分。一、阻断STAT3磷酸化对人脑胶质母细胞瘤细胞体外增殖抑制目的检测人脑胶质母细胞瘤组织标本与细胞中STAT3及其磷酸化活化蛋白的表达情况,研究人脑胶质母细胞瘤中STAT3的异常表达及持续活化的意义及应用JSI-124靶向性阻断STAT3信号通路对人脑胶质母细胞瘤细胞增殖的抑制效应。方法1、临床收集9例原发胶质母细胞瘤（WHOⅣ级）和3例正常脑标本组织。Western blot方法检测组织标本和胶质母细胞瘤细胞系A172与U251的STAT3总蛋白和705位磷酸化活化蛋白表达水平,并对其异常表达及持续活化的情况进行分析。2、不同浓度JSI-124作用A172和U251细胞24、48及72小时后,用CCK-8法检测肿瘤细胞STAT3号通路阻断前后细胞增殖的改变,检测450 nm、630 nm双波长各孔吸光度值OD450-630。以每个时间点空白对照组吸光值作为1并计算各组相对生长率。相对生长率=各组OD450-630/空白对照组OD450-630。3、不同浓度的JSI-124处理人胶质母细胞瘤U251和A172细胞24小时后显微镜观察细胞形态学的改变。4、Western blot方法检测人胶质母细胞瘤A172、U251细胞在JSI-124不同浓度和不同时间作用下STAT3和p-STAT3（Tyr705）蛋白的表达情况。结果1、STAT3在人胶质母细胞瘤手术标本和细胞系中的表达在所选用的胶质母细胞瘤9例标本中,发现所有的肿瘤标本STAT3总蛋白均有表达;有1例标本未检测到p-STAT3（Tyr705）的表达,阳性率为88.89%。大部分肿瘤标本p-STAT3（Tyr705）为高表达,2例标本p-STAT3（Tyr705）的表达量相对较少。正常脑组织标本中STAT3总蛋白表达较少,并且2例p-STAT3（Tyr705）不表达,另1例表达极少。A172和U251细胞中STAT3总蛋白和p-STAT3（Tyr705）活化蛋白都呈高表达状态,并且两者的表达量相近。2、JSI-124对胶质母细胞瘤细胞增殖的影响CCK-8法检测发现,溶媒介质DMSO对A172和U251细胞的增殖均无影响而JSI-124可明显抑制U251、A172细胞的增殖。并且,JSI-124对胶质母细胞瘤细胞的作用存在浓度效应和时间效应,作用48小时后,100 nM JSI-124对两种细胞的增殖抑制率超过50%。统计学分析各用药组与对照组比较均有显著性差异（P＜0.05）。3、JSI-124对胶质母细胞瘤细胞形态学的影响显微镜下观察发现,不同浓度JSI-124作用A172、U251细胞24小时后,DMSO对细胞的形态和细胞密度无影响,而随着JSI-124浓度的增加细胞密度逐渐降低,并且在1000 nM时细胞明显变形,突起减少、细胞变圆变亮。与对照组相比较,U251、A172细胞分别在JSI-124浓度为100、200 nM时细胞密度变稀,而细胞形态无明显改变,而U251、A172分别在200、400 nM时均表现为细胞密度明显变稀和细胞明显变形。4、JSI-124对胶质母细胞瘤细胞STAT3磷酸化水平的影响以A172细胞为研究对象,Western Blot方法检测发现,DMSO对细胞STAT3活化状态无影响。DMSO组和空白对照组相比,无论是STAT3总蛋白的表达,还是在Try705位点的磷酸化的STAT3表达均无明显差异。与对照组比较,各实验组STAT3总蛋白在同种细胞内表达基本相同或变化很小,且不受JSI-124浓度影响。两种细胞p-STAT3（Tyr705）蛋白的表达则都明显随JSI-124浓度的升高而逐步降低,这说明STAT3的磷酸化水平受到了JSI-124的抑制,抑制程度与JSI-124的浓度相关。在JSI-124 100 nM时,A172和U251细胞中p-STAT3（Tyr705）蛋白表达都减少,在200 nM抑制更为明显,并且在JSI-124 400 nM时p-STAT3（Tyr705）蛋白的表达最少。JSI-124抑制p-STAT3（Tyr705）蛋白的表达随着时间的延长抑制效果增强,作用24小时效果最明显,存在时间依赖关系。然而,STAT3总蛋白表达则不随作用时间变化而改变。所以,JSI-124可以通过抑制STAT3酪氨酸磷酸化形成p-STAT3（Tyr705）,从而抑制STAT3形成二聚体达到阻断这一信号转导通路,并且抑制效果呈时间和浓度依赖关系。结论1、人脑胶质母细胞瘤组织和细胞系中STAT3的过高表达及持续活化具有普遍意义,说明STAT3信号传导通路在人脑胶质母细胞瘤的发生、发展具有重要作用,可作为人脑胶质母细胞瘤一个有效和潜在的治疗靶点。2、U251和A172细胞中存在STAT3和磷酸化STAT3的异常表达,可以作为本课题的研究对象。3、JSI-124具有高效透膜特性,能够直接、有效抑制STAT3磷酸化,靶向性阻断STAT3信号通路。但是,这是一相对缓慢的过程。4、JSI-124能够安全有效地抑制人脑胶质母细胞瘤细胞增殖。二、JSI-124阻断STAT3信号通路对肿瘤细胞凋亡、细胞周期的影响及机制研究目的检测JSI-124对人脑胶质母细胞瘤细胞周期和凋亡的影响,并分析凋亡和细胞周期相关基因变化,进而深入探讨JSI-124靶向性阻断STAT3信号通路抑制人脑胶质母细胞瘤细胞增殖的相关机制。方法1、用流式细胞仪检测JSI-124处理36小时后的A172、U251细胞分别在0、100、200 nM和0、50、100 nM的细胞凋亡率。传统的PCR扩增β-actin分析所提RNA质量;JSI-124作用A172、U251细胞24小时后,Real-time PCR检测STAT3下游相关靶基因Bcl-xl和Survivin的mRNA相对表达水平的影响。2、用流式细胞仪检测JSI-124处理A172和U251细胞及对照组NIH3T3细胞36小时后的细胞周期情况。在基因水平采用Real-time PCR检测细胞周期调控基因cdc2和cyclin B1变化,同时Western blot方法分析JSI-124对cdc2和cyclinB1基因蛋白表达水平的影响。结果1、JSI-124阻断STAT3信号通路促进胶质母细胞瘤细胞凋亡及JSI-124对抗凋亡基因表达的影响随着JSI-124浓度的增加,A172和U251细胞的凋亡比例呈上升趋势。A172细胞凋亡比例从12.75±1.95%到19.75±5.00%再增加到31.46±6.83%,差异明显有统计学意义（P＜0.05）;U251细胞凋亡率从0 nM的12.77±3.48%增加到100 nM的27.56±4.84%（P＜0.05）。通过Real-time PCR检测,药物处理组与对照组相比两种基因均有明显降低,转录水平的Bcl-xl和Survivin基因在A172分别被抑制了65.66%（P＜0.01）和85.22%（P＜0.01）,而在U251细胞也分别被抑制了43.79%（P＜0.05）和73.13%（P＜0.01）,差异明显有统计学意义。2、JSI-124阻断STAT3信号通路诱导细胞周期G2/M期阻滞及JSI-124对周期调控基因的影响流式细胞仪检测JSI-124处理36小时后细胞周期:在200 nM浓度下,A172细胞G2/M期比例从10.78±1.48%上升到42.88±5.14%,而S期则从24.54±2.33%下降到14.28±1.53%;同样,JSI-124处理U251细胞引起相似的G2/M和S期的改变;而阴性对照NIH3T3细胞在0、200 nM浓度下G2/M和S期无明显改变,G2/M期从5.68±0.74%到7.17±0.99%（P＞0.05）,S期也从12.83±0.15%变为15.67±0.06%（P＞0.05）。JSI-124作用A172细胞24小时后,荧光定量PCR检测发现,与对照组相比,处理组的cdc2和cyclin B1基因相对表达分别降到0.22±0.02（P＜0.01）和0.11±0.03（P＜0.01）,而U251细胞处理组的cdc2和cyclin B1基因分别降到0.69±0.07和0.37±0.08（P＜0.05）。Western blot方法检测蛋白的表达情况,与mRNA变化相似,A172细胞处理组cdc2和cyclin B1蛋白较对照组有明显的较少,而U251细胞cyclin B1蛋白较对照组有明显的较少,同时cdc2蛋白表达在两组无明显的改变。结论1、JSI-124能够通过下调凋亡相关基因诱导胶质瘤母细胞瘤细胞凋亡。2、JSI-124能够通过下调细胞周期相关基因阻滞胶质瘤母细胞瘤细胞从G2期向M期转换。总之,胶质母细胞瘤中STAT3普遍活化,并且对于肿瘤的发生、发展具有重要的作用;JSI-124能对STAT3功能进行特异性抑制,通过促进肿瘤细胞凋亡和细胞周期G2/M期阻滞抑制细胞增殖,体外实验已显示出明显的治疗效果,有利于进一步进行动物体内实验观察,为胶质母细胞瘤治疗提供了新的方向,这也为其他恶性肿瘤的靶向阻断治疗研究提供帮助。
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