耗氧型光纤DCP传感器敏感材料的制备与性能研究

论文摘要

2,4-二氯苯酚（2,4-dichlorophenol,DCP）是一种毒性较强且难降解的环境污染物。已被美国环保局和我国政府列为必须首先控制的有毒化合物,因此检测DCP含量对环境保护和人类健康具有重要的意义。本学位论文分别以磁性壳聚糖纳米复合粒子（magnetic chitosan nanoparticles,MCN）固定化漆酶、酞菁铜仿生酶为生物识别元件,构建了基于固定化漆酶、仿生酶催化的耗氧型光纤DCP传感器,实现了对环境污染物DCP的检测。本学位论文在以下几个方面进行了系统的研究。第一,对杂色云芝菌漆酶的培养和纯化条件进行了研究,制备了比活力为28.4 U/mg的漆酶;第二,采用反相悬浮聚合法制备了MCN,以其为载体固定漆酶,研究了固定化的最优条件,以2,2’-连氮-双-（3-乙基苯并噻吡咯啉-6-磺酸）（ABTS）为底物研究了游离漆酶和固定化漆酶的催化性能;第三,分别研究了漆酶催化DCP和漆酶-介体体系中漆酶催化DCP的机理,确定了漆酶和固定化漆酶催化DCP的最适条件以及漆酶-介体体系中漆酶和固定化漆酶催化DCP的最适条件;第四,制备3种金属酞菁,对金属酞菁催化氧化DCP的最适条件和机理进行了研究;第五,设计和构建了基于固定化漆酶、仿生酶催化的光纤DCP传感器,研究了传感器的性能。本学位论文的主要结论包括以下几个方面:（1）采用液体发酵法对培养杂色云芝菌漆酶的培养条件进行了优化,分离和纯化了杂色云芝菌漆酶,以ABTS为底物研究了其酶学性质。最优培养条件为:土豆汁20%,pH值为5.0,葡萄糖20.0 g/L,蛋白胨4.0g/L,CuSO4 1.0 mmol/L,KH2PO43.0g/L,MgSO4 1.5 g/L,ZnSO40.5g/L,MnSO40.5 g/L,ABTS 1.0 mmol/L,Tween-80 0.10%,28℃,130 rpm/min摇瓶培养13d。采用超滤、硫酸铵分级、DEAE-Sepharose Fast Flow及Sephadex G-100柱层析对漆酶粗酶液进行分离纯化,分离纯化的漆酶酶粉的比活力为28.4 U/mg,分子量为64.4 kD,其同工酶分子量为35.8 kD。该漆酶催化ABTS的最佳pH值为2.0,最佳温度为55℃,25℃时漆酶催化ABTS的Km值为7.78μmol/L,Vmax为5.11×10-5L·mol-1·min-1。该漆酶储存稳定性能良好,在-18℃放置1个月其酶活仍保持90.2%。（2）采用反相悬浮法制备了平均粒径约为104.5 nm的MCN。采用TEM、FI-IR对MCN的结构进行了表征。研究了MCN的磁性能及抗氧化性能。结果表明,MCN具有超顺磁性,矫顽力为10.27 Oe,抗氧化性良好,易于磁分离。以MCN为载体固定漆酶,研究了MCN固定漆酶的最适条件。固定化过程分为戊二醛活化和漆酶交联两步。戊二醛活化的最优条件为:50 mg MCN在pH7.0的磷酸缓冲液浸泡12 h,25℃时,在1%的戊二醛中活化2 h;漆酶交联的最优条件为:将活化好的MCN磁分离后,置于漆酶浓度为1.0 mg/mL的pH 6.0的磷酸缓冲液,4℃交联4 h。最优条件下制备的固定化漆酶固载率为28%,比活力为670 U/g。以ABTS为底物研究了固定化漆酶的酶学性质,结果表明,固定化漆酶催化ABTS的最适pH值为2.0,最适温度为50℃,25℃时Km=23.38μmol/L,Vmax=3.53×10-5mol·L-1·min-1,固定化漆酶具有良好的热稳定性、操作稳定性和储存稳定性。（3）研究了漆酶催化氧化DCP的机理以及漆酶和固定化漆酶催化氧化DCP的最适条件,漆酶和固定化漆酶催化DCP的最佳pH均为5.0,最佳温度分别为45℃和55℃。动力学研究结果表明,漆酶对DCP的催化氧化符合一级反应动力学方程。在漆酶-ABTS介体体系中,ABTS起到了电子传递的作用,加入介体以后,DCP的氧化速度明显提高。游离漆酶催化DCP氧化的机理研究表明催化反应是由四个化学反应组成的,醌式中间体的生成速度与每个反应的速度常数有关,亦即与漆酶、介体、底物的浓度有关。在漆酶-介体体系中,游离漆酶和固定化漆酶催化DCP的最适pH和最适温度分别为4.5和50℃。（4）制备了3种金属酞菁（CuPc、MnPc、CoPc）,研究了金属酞菁对DCP的催化性能。金属酞菁催化DCP的最适pH为8.0的磷酸缓冲液,最适温度为55℃,最佳金属酞菁用量为5.0 mg·mL-1。（5）分别以固定化漆酶、酞菁铜为生物识别元件,采用锁相放大技术构建了两种光纤DCP传感器,研究了传感器的性能并对DCP含量进行测定。结果表明,基于固定化漆酶催化的光纤DCP传感器的线性检测范围为1.0×10-7-9.0×10-5mol/L,检测下限为4.4×10-8mol/L,响应时间为40 s;基于酞菁铜仿生酶催化的光纤DCP传感器线性检测范围在1.0×10-6-9.0×10-5mol/L,检测下限为7.4×10-7mol/L,响应时间为600 s。两种传感器均有较好的重复性和长期稳定性。将两种传感器应用于长江水和加入DCP的长江水的检测,并与高效液相色谱的测定结果进行了比较研究。结果表明,2种传感器的检测效果好,精度高。对于基于固定化漆酶催化的光纤DCP传感器,Mg2+、Ca2+的加入使得检测结果偏高,加入EDTA作螯合剂,能消除Mg2+、Ca2+的影响。在基于酞菁铜催化的光纤DCP传感器中加入Mg2+、Ca2+对检测结果没有影响。

论文目录

摘要

ABSTRACT

第1章绪论

1.1 基于酶催化的光纤生物传感器的特点与分类

1.1.1 基于酶催化的光纤生物传感器的特点

1.1.2 基于酶催化的光纤生物传感器的分类

1.2 漆酶的研究进展

1.2.1 漆酶的结构及催化机理

1.2.2 漆酶的培养与纯化

1.2.3 漆酶的应用

1.3 固定化酶的研究进展

1.3.1 固定化酶的特点

1.3.2 酶的固定化方法

1.3.3 酶的固定化载体

1.4 仿生酶及其研究进展

1.4.1 仿生酶的概念

1.4.2 仿生酶的分类

1.5 DCP的检测研究现状

1.5.1 分光光度法

1.5.2 荧光法

1.5.3 色谱法

1.5.4 荧光免疫法

1.5.5 传感器测定法

1.6 选题的目的、意义与主要内容

1.6.1 选题的目的、意义

1.6.2 课题的来源及研究的主要内容

第2章漆酶的培养、纯化及部分酶学性质

2.1 实验部分

2.1.1 试剂与仪器

2.1.2 菌种

2.1.3 培养基组成

2.1.4 培养方法

2.1.5 杂色云芝菌漆酶培养条件的优化

2.1.6 粗酶液的制备

2.1.7 上柱样品的制备

2.1.8 层析

2.1.9 漆酶活力与蛋白质含量的测定

2.1.10 分子量的测定

2.1.11 漆酶的酶学性质研究

2.2 结果与讨论

2.2.1 漆酶的培养

2.2.2 漆酶的纯化

2.2.3 漆酶的部分酶学性质

2.3 小结

第3章磁性壳聚糖纳米复合粒子的制备及固定化漆酶的性能研究

3.1 实验部分

3.1.1 试剂和仪器

3.1.2 磁性壳聚糖纳米复合粒子的制备

3.1.3 磁性壳聚糖纳米复合粒子的测试与表征

3.1.4 固定化漆酶活性测定方法

3.1.5 漆酶固定化过程最适条件的优化

3.1.6 固定化漆酶催化ABTS的性能研究

3.2 结果与讨论

3.2.1 磁性壳聚糖纳米复合粒子的制备

3.2.2 磁性壳聚糖纳米复合粒子的结构与表征

3.2.3 漆酶固定化最适条件的选择

3.2.4 固定化漆酶催化ABTS的最适条件和稳定性

3.3 本章小结

第4章漆酶催化DCP氧化的性能与机理研究

4.1 实验部分

4.1.1 试剂与仪器

4.1.2 漆酶催化DCP氧化的机理及性能研究

4.1.3 漆酶-介体体系中漆酶催化DCP氧化的性能及机理研究

4.2 结果与讨论

4.2.1 漆酶及固定化漆酶催化DCP氧化的性能研究

4.2.2 漆酶-介体体系中漆酶催化DCP氧化的性能与机理研究

4.3 本章小结

第5章基于固定化漆酶催化的光纤DCP传感器的研究及应用

5.1 荧光猝灭与检测

5.2 光纤DCP传感器的原理

5.3 实验部分

5.3.1 试剂和仪器

5.3.2 高效液相色谱法测DCP

5.3.3 光学氧敏感膜的制备

5.3.4 基于固定化漆酶催化的光纤DCP传感器的性能研究

5.4 结果与讨论

5.4.1 高效液相色谱法测DCP

5.4.2 光学氧敏感膜的性能

5.4.3 基于固定化漆酶催化的光纤DCP传感器的性能研究

5.5 本章小结

第6章金属酞菁仿生酶催化DCP氧化的性能及应用

6.1 实验部分

6.1.1 试剂与仪器

6.1.2 金属酞菁的制备

6.1.3 金属酞菁的表征

6.1.4 金属酞菁仿生酶催化DCP氧化的性能研究

6.1.5 基于酞菁铜催化的光纤DCP传感器研究

6.2 结果与讨论

6.2.1 金属酞菁的结构与表征

6.2.2 金属酞菁催化DCP氧化的性能研究

6.2.3 金属酞菁催化DCP氧化的机理研究

6.2.4 基于酞菁铜催化的光纤DCP传感器研究

6.3 本章小结

第7章结论与展望

7.1 结论

7.2 本研究的创新点

7.3 展望

参考文献

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致谢

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