杀虫微生物菌株的多重抗性筛选

论文摘要

新型多杀菌素的结构与多杀菌素非常相似,唯一不同的是在C21位置上不是典型的乙基。迄今为止,研究人员已从Saccharopolyspora pogona的发酵液中提取出了三十多种与多杀菌素结构不同的化合物,但主要成份是新型多杀菌素A和D。与多杀菌素相比,新型多杀菌素具有更广的杀虫谱系和更高的杀虫活性,对它的进一步研究将会对我国生物杀虫剂的研究产生重要的意义。新型多杀菌素的性能比多杀菌素要好,但是目前最大的问题就是它的产率非常低,从而影响进一步的研究。微生物获得特定类型的抗性突变,不仅反映了其核糖体或RNA多聚酶上相关靶位点结构的改变,也对突变菌株次级代谢产物（抗生素等）的生物合成能力产生深刻影响,因此筛选抗性突变株可作为微生物推理选育的途径之一。核糖体工程主要是利用抗性筛选使菌株获得特定的抗性突变,由突变引起的核糖体或RNA聚合酶相关位点的结构变化不仅影响了菌株内蛋白质的合成,同时也改变了次级代谢产物生物合成的调控系统,诱导微生物过量合成次级代谢产物。通过筛选抗性标记得到的突变菌株,能高效的获得正向突变的菌株,一般表现为次级代谢产物产量的增加,或者在生产能力、代谢速度、传代稳定性等方面有明显的改善和提高。基于以上考虑,本研究首先在测定了S. pogona的生长曲线和发酵过程曲线的基础上,通过核糖体工程技术方法获得了一株双重抗性突变株SG58,其发酵产物相对产量是起始菌株的3.89倍。经过六次传代,双重抗性突变株SG58的发酵相对产量基本保持稳定,表明其遗传性状比较稳定。此外本文首次对S. pogona编码核糖体S12蛋白的rpsL基因进行了分析。经过基因测序发现该菌株链霉素抗性突变前后的rpsL序列并没有发生变化,就是说其对应的氨基酸也没有变化,本实验预期的寻找rpsL突变位点的结果并没有出现。磷酸泛酰巯基乙胺转移酶类（PPTases）是催化初级代谢中的脂肪酸合酶和次级代谢中的聚酮合酶和非核糖体多肽的载体蛋白翻译后修饰活化的重要过程。磷酸泛酰巯基乙胺化是由4’-磷酸泛酰巯基乙胺（P-pant）辅基从辅酶A上转移到保守载体蛋白的丝氨酸残基上使载体蛋白由无活性的脱辅基（apo-）形式转变为活性全蛋白（holo-）形式。本实验将刺糖多胞菌的PPTase基因克隆表达并进行了初步的功能研究。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 1 引言
• 1.1 糖多孢菌属概述
• 1.2 多杀菌素类杀虫剂的作用机理
• 1.3 新型多杀菌素与多杀菌素的异同
• 1.4 新型多杀菌素的生物合成
• 1.4.1 聚酮链的生物合成与修饰
• 1.4.2 鼠李糖基与福乐糖胺的生物合成与连接
• 1.4.3 新型多杀菌素生物合成基因簇侧翼基因
• 1.5 核糖体工程
• 1.6 核糖体工程的研究进展
• 1.7 磷酸泛酰巯基乙胺转移酶研究现状
• 1.8 立题依据与意义
• 1.9 研究思路与方法
• 1.9.1 S.pogona抗性突变株的获得
• 1.9.2 突变前后的rpsL基因测序及对比
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基与抗生素
• 2.1.3 试剂
• 2.1.4 引物
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 方法
• 2.2.1 S.pogona生长曲线和发酵过程曲线的测定
• 2.2.2 S.pogona单孢子悬液的制备
• 2.2.3 孢子悬液的涂布方法
• 2.2.4 孢子悬液的最低抑菌浓度（MIC）的测定
• 2.2.5 抗性突变菌株的获得
• 2.2.6 突变子的初筛
• 2.2.7 突变子的发酵及产物的HPLC检测
• 2.2.8 S.pogona总DNA的制备
• 2.2.9 PCR扩增rpsL基因
• 2.2.10 TA克隆
• 2.2.11 感受态细胞的制备
• 2.2.12 重组质粒转化感受态细胞
• 2.2.13 阳性转化子的筛选
• 2.2.14 大肠杆菌质粒DNA的小量提取
• 2.2.15 重组质粒酶切检测
• 2.2.16 蛋白表达及纯化
• 3 结果与分析
• 3.1 S.pogona生长曲线
• 3.2 新型多杀菌素发酵过程曲线
• 3.3 S.pogona单孢子悬液的制备
• 3.4 最低抑菌浓度（MIC）的测定
• 3.5 突变子的发酵及产物的HPLC检测
• 3.6 突变菌株的rpsL基因序列测定
• 3.7 突变菌株遗传稳定性
• 3.8 PPTase基因的克隆、表达及活性测定
• 3.8.1 PPTase基因的克隆、测序及表达载体的构建
• 3.8.2 PPTase蛋白的表达检测和纯化
• 4 讨论
• 4.1 S.pogona的生长曲线和发酵过程曲线
• 4.2 抗生素抗性筛选
• 4.3 rpsL基因上链霉素突变位点的检测
• 4.4 来源于刺糖多孢菌的磷酸泛酰巯基乙胺腺苷酰转移酶
• 结语
• 参考文献
• 附录
• 本论文感谢以下科技项目的资助
• 致谢