论文题目: 棉花悬浮细胞系的建立及其培养细胞的程序性死亡的观察研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 作物遗传育种
作者: 夏启中
导师: 张献龙
关键词: 棉花,细胞悬浮培养,程序性死亡,诱导因子,生长素,高浓度细胞分裂素,黄萎病粗毒素
文献来源: 华中农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 细胞的死亡一般分为程序性死亡和坏死两种。细胞程序性死亡(programmed cell death, PCD)是指生物在发育和胁迫反应中的一种受基因控制的、主动的、有序的细胞死亡过程。对动物细胞程序性死亡的研究表明,PCD一般具有比较典型的形态和生化特征,即细胞收缩、核浓缩、染色质边缘化、核DNA被剪切成寡聚核小体大小的片断并最终被膜包围形成凋亡小体。核DNA降解断裂产生带有3`—OH端的寡聚核小体片断,在凝胶电泳上呈以140-180bp倍增的DNA“梯”(DNA ladder)。坏死(necrosis)是一种不受细胞控制的损伤性细胞死亡过程,坏死细胞不能呈现出DNAladder。根据DNA ladder的有无,可以将PCD与细胞坏死区分开来。对整株植物进行PCD机理的研究常常要涉及到要将死亡细胞从正常细胞区分开来,而每个单个细胞细胞都有其内在的死亡表达程序。因此,建立由单细胞或原生质体组成的悬浮系可以大大的降低细胞环境的复杂性,可作为PCD研究的理想系统,对研究PCD的基因表达调控机理和信号传导途径非常有利。近年来,对植物细胞程序性死亡的研究报道不断增多,其中很多工作都是从悬浮细胞系着手的。 本试验选用陆地棉(Gossypium hirsutum. L)品种“珂字201”和“鄂抗9”作为试验材料,从无菌苗下胚轴切段诱导愈伤组织,建立棉花悬浮细胞系;同时对棉花悬浮细胞系建立过程中激素的配比和浓度、培养基成分、悬浮细胞的生长过程进行了较系统的研究。结果表明:MS+2,4-D 0.5mg/L+KT 0.1mg/L和MS+2,4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L培养基有利于细胞分裂,能产生体积较大,均匀一致,细胞活力强的单细胞和小细胞团,适合于进行细胞生长调控及PCD研究。而MS+IBA 0.5mg/L+KT 0.1mg/L和MS+IBA 0.1mg/L+KT 0.1mg/L培养基则有利于形成大的细胞团和不同时期的胚状体,适合于进行胚状体的发生发育的研究。钾盐、肌醇有利于细胞的分裂增殖,且能抑制胚状体的发生。可以通过增加钾盐(K~+)、肌醇含量来调节细胞的生长状态和细胞活性,以建成分裂增殖快、细胞活性强的悬浮细胞系。在悬浮培养过程中,管状细胞渐渐消失,被球状的单细胞和小细胞团所替代。棉花胚性愈伤悬浮细胞的生长曲线呈S形,在起始培养的0～3d,是生长的延迟期;在第3～15d,是指数增长期;到第15d以后,生长速度降低,是静止期。悬浮培养的棉花细胞必须在15d以前进行继代,以保持其旺盛的分裂能力和细胞活性。 试验中以棉花悬浮细胞系为研究对象,探讨了在自然衰老和在热激、喜树碱、
论文目录:
摘要
ABSTRACT
缩略词表
1 前言
1．1 问题的提出
1．2 前人研究进展
1．2．1 利用植物悬浮细胞细胞系进行 PCD研究的现状
1．2．2 动物细胞程序性死亡及其机理
1．2．3 植物细胞程序性死亡及其机理
1．2．4 植物细胞程序性死亡的环境胁迫诱导
1．2．5 细胞程序性死亡与高等植物的发育
1．2．6 细胞程序性死亡的检测技术
2 材料和方法
2．1 棉花胚性愈伤组织的诱导及悬浮培养条件
2．2 棉花胚性愈伤组织悬浮培养的生长曲线的绘制
2．3 细胞染色和显微观察
2．4 生长素及凋亡抑制剂处理试验
2．5 细胞分裂素浓度试验
2．6 热激诱导处理
2．7 喜树碱、串珠镰孢菌毒素和放线菌酮处理
2．8 基因组 DNA抽提和琼脂糖凝胶电泳分析
2．9 棉花黄萎病菌粗毒素的提取及粗毒素处理
3 结果与讨论
3．1 棉花悬浮细胞系的建立及其影响因素分析
3．1．1 不同起始愈伤对棉花胚性愈伤组织悬浮细胞系建立的影响
3．1．2 不同激素及浓度配比对棉花胚性愈伤悬浮细胞生长的影响
3．1．3 不同培养基成分对棉花胚性愈伤悬浮细胞生长的影响
3．1．4 棉花胚性愈伤悬浮细胞生长过程的细胞学观察
3．1．5 棉花胚性愈伤悬浮培养的生长曲线
3．1．6 讨论
3．2 在自然衰老和在热激、喜树碱、串珠镰孢菌毒素、放线菌酮等诱导条件下棉花悬浮细胞程序性死亡的发生
3．2．1 棉花胚性愈伤悬浮细胞在自然衰老过程中细胞程序性死亡的发生
3．2．2 热激诱导棉花悬浮细胞程序性死亡的发生
3．2．3 喜树碱、串珠镰孢菌毒素和放线菌酮诱导棉花悬浮细胞程序性死亡的发生
3．2．4 不同生理状态的细胞对上述诱导因子的反应不同
3．2．5 讨论
3．3 撤除外源生长素可诱导棉花胚性悬浮细胞发生程序性死亡
3．3．1 外源生长素的撤除引起棉花胚性悬浮细胞大规模死亡现象
3．3．2 上述现象是细胞程序性死亡的细胞学证据
3．3．3 DNA梯度分析
3．3．4 水解酶抑制剂(NEM、TLCK)和 Caspase抑制剂(AC-YVAD-CMK对上述细胞死亡的效应
3．3．5 讨论
3．4 高浓度细胞分裂素诱导棉花悬浮细胞程序性死亡的发生
3．4．1 高浓度的细胞分裂素可引起棉花胚性悬浮细胞大量死亡
3．4．2 高浓度的细胞分裂素引起的棉花胚性悬浮细胞死亡中伴随有DNA梯出现
3．4．3 高浓度的细胞分裂素引起的棉花胚性悬浮细胞死亡的细胞学特征
3．4．4 两种不同生理状态的棉花悬浮细胞对高浓度的细胞分裂素的敏感性不同
3．4．5 不同生长时期的棉花悬浮细胞对高浓度的细胞分裂素的敏感性不同
3．4．6 激素互作对高浓度细胞分裂素诱导的 PCD的影响
3．4．7 讨论
3．5 黄萎病毒素诱导处理棉花悬浮细胞
3．5．1 黄萎病粗毒素处理浓度的筛选
3．5．2 黄萎病粗毒素对棉花悬浮细胞死亡的诱导
3．5．3 讨论
参考文献
致谢
附录 攻读博士学位期间发表的论文
发布时间: 2005-12-05
参考文献
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