花背蟾蜍视网膜形态发育及视网膜生理活动对角膜诱导影响研究

论文摘要

花背蟾蜍（Bufo Raddei Strauch）是本实验室研究眼睛发育常用的两栖类模式动物。本文利用常规组织学技术、透射电镜技术、扫描电镜技术和免疫组织化学技术对花背蟾蜍视网膜进行了如下研究：（1）视网膜形态结构及胚后形态发育过程研究,（2）视网膜生理活动与角膜诱导关系研究,（3）不同龄期蟾蜍视网膜增殖细胞分裂能力研究。利用光镜技术和电镜技术对正常成体花背蟾蜍视网膜形态进行了观察,研究结果显示,光镜下花背蟾蜍视网膜具有脊椎动物视网膜典型的十层结构。透射电镜下观察花背蟾蜍视网膜结构特点为：视网膜色素上皮细胞胞质内存在独特的巨大吞噬体；在光感受器细胞内节可观察到椭球体与肌样体结构,视锥细胞内节未观察到起滤色作用脂滴；光感受器细胞外节周围可见辅助外节和花萼状突起断面；光感受器细胞的内突部分与第二级神经元形成突触带。扫描电镜对视网膜色素上皮观察可见排列整齐的色素细胞突起。视网膜断面观察可看到大量的视杆细胞和少数视锥细胞。视杆细胞外、内节表面分布明显的小叶间沟。围绕在光感受器细胞内节周围可见Muller细胞突起形成的外界膜。利用GFAP抗体对视网膜切片进行免疫组化染色发现,Muller细胞是花背蟾蜍视网膜中唯一的胶质细胞,视野中可见它沿着眼球半径呈单层放射状排列的横断面,Muller细胞主干终末膨大形成的圆锥型终足分布于内界膜。利用半薄切片技术及电镜技术对花背蟾蜍26-39期（胚后发育期）蝌蚪视网膜发育过程观察发现,视网膜分层区域逐渐从中央向边缘区扩展。在26、27、28和35期蝌蚪视网膜的边缘存在一逐渐闭合的裂孔结构。透射电镜观察可见到26至39期色素细胞色素颗粒逐渐增加,突起逐渐伸长。同时可观察到光感受器细胞外节内的膜盘增多,视锥细胞内节特有的含脂质色素脂滴逐渐形成过程。用移植皮肤将蝌蚪角膜替换,移植皮肤在一定因素诱导下透明成为角膜即角膜诱导。利用眶内注射河豚毒素阻断蝌蚪视神经生理活动,观察不同时间点移植角膜中黑素色颗粒数量变化发现,实验组角膜与对照组角膜黑素色颗粒都随着时间延续逐渐减少,但实验组角膜透明过程显著慢于对照组,两者差异显著（p<0.05）。此结果说明视网膜生理活动是诱导角膜透明的直接因素之一。为了观察花背蟾蜍视网膜内神经细胞增殖能力与蟾蜍年龄关系,利用Skeletochronology技术对花背蟾蜍年龄进行了鉴定,并对其群体年龄结构和生长模式进行了分析,分析结果显示实验中所用的成体花背蟾蜍年龄可达到6龄。利用BrdU标记分裂细胞的方法,对花背蟾蜍30、35、39期蝌蚪、变态后幼体,以及1龄、2龄、3龄成体视网膜增殖细胞进行显示表明,随着花背蟾蜍生长时间延续,其视网膜中具有分裂能力的神经细胞逐渐减少,2龄期视网膜中几乎没有增殖细胞存在。由此可以推论无尾两栖动物可能是视网膜神经细胞由终生保持分裂能力到短期保持分裂能力的过渡动物。本研究从以上3方面对花背蟾蜍视网膜进行观察研究,在视网膜形态结构方面观察到色素上皮细胞中存在着巨大吞噬体、在胚后发育中观察到的视网膜裂孔、以及神经细胞分裂能力与年龄的关系、视网膜生理活动与角膜诱导关系等,为今后进一步进行相关研究奠定了研究基础。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 目录
• 第一章 文献综述
• 1.1 视网膜结构与细胞分化
• 1.1.1 视网膜模式结构
• 1.1.2 视网膜神经细胞分化研究现状
• 1.2 视神经发育、损伤和再生
• 1.2.1 视神经发育
• 1.2.2 神经损伤与再生
• 1.2.3 视神经发育和再生的分子机制研究
• 1.3 角膜诱导与视神经、视网膜的关系
• 1.4 本研究立题思想
• 第二章 花背蟾蜍视网膜形态结构研究
• 2.1 前言
• 2.2 实验动物
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 光镜观察样品制作
• 2.3.2 透射电镜观察样品制作
• 2.3.3 扫描电镜观察样品制作
• 2.3.4 免疫组化染色
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 视网膜光镜结构
• 2.4.2 视网膜透射电镜结构
• 2.4.3 视网膜扫描电镜结构
• 2.4.4 显示Mu ll er细胞的免疫组化染色
• 2.5 讨论
• 第三章 花背蟾蜍视网膜胚后发育
• 3.1 前言
• 3.2 实验动物
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 半薄切片制作
• 3.3.2 电镜观察样品制作
• 3.4 结果
• 3.4.1 半薄切片观察
• 3.4.2 花背蟾蜍视网膜胚后发育期电镜观察
• 3.5 讨论
• 第四章 花背蟾蜍视网膜生理活动对角膜诱导影响
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 实验动物
• 4.2.2 角膜移植操作
• 4.2.3 动物分组
• 4.2.4 角膜组织学切片制作与观察
• 4.3 结果
• 4.4 统计分析
• 4.5 讨论
• 第五章 花背蟾蜍年龄鉴定研究
• 5.1 前言
• 5.2 实验动物和实验方法
• 5.2.1 实验动物
• 5.2.2 实验方法
• 5.3 实验结果
• 5.4 讨论
• 第六章 花背蟾蜍视网膜中细胞持续分裂能力初步观察
• 6.1 前言
• 6.2 实验动物
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 增殖细胞标记和免疫组化染色
• 6.3.2 利用Skeletochronology方法对成体蟾蜍年龄鉴定
• 6.4 结果
• 6.5 讨论
• 参考文献
• 在学期间的研究成果
• 致谢