论文摘要
乙型肝炎病毒（HBV）载体是近几年新发展的一种病毒载体,不仅具有天然嗜肝特异性,而且具备改造为肝靶向性基因治疗载体的基本条件。主要包括:在肝细胞内持续复制、反复感染,病毒本身对细胞没有明显的细胞毒性;能够携带外源基因并被包装成病毒颗粒;能够介导外源基因的转移和表达;但由于基因结构复杂,目前改造的HBV载体均存在载容量小、复制包装效率低及安全性差等缺点,而且HBV载体制备困难,感染效率低,为解决目前存在的困难,有必要使其与其他病毒载体联合应用。如与腺病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体或逆转录病毒载体联合应用,实现高载容量、高转染效率、高复制能力,充分发挥HBV载体嗜肝导向性,可以利用体内野生型HBV为之提供包装,在体内形成具有抗HBV作用的HBV样颗粒,或携带治疗性目的基因,进一步感染其他肝细胞,实现放大效应。因此,通过病毒载体之间的重组,拓宽了HBV载体应用领域,不仅有望用于抗HBV基因治疗,也可以用于制备DNA疫苗、筛选抗病毒药物或通过携带外源性标志基因用于HBV分子生物学研究等。本研究通过构建新型的HBV载体表达不同的目的基因,构建了持续分泌表达BsdR重组HBV的的细胞系,用于HBV的分子生物学研究或筛选HBV易感细胞系;或与腺病毒载体联合构建了表达MMP8等目的基因的质粒,用于抗肝硬化的基因治疗,为HBV的分子生物学研究和肝硬化的生物治疗等开辟了新途径。本研究共分3部分完成。第一部分新型HBV载体的构建目的应用分子生物学技术改造HBV载体,阻断其结构基因的表达,提高HBV载体作为基因治疗载体的安全性,使其更适用于作为基因治疗载体。方法:1 pCH-M5-GFP质粒的构建通过改变pCH-S-GFP的起始密码子或添加终止密码子,删除了HBV质粒中Core、HBV-DNAP、pre-S1、pre-S2、S and X等结构蛋白的表达,构建pCH-M5-GFP质粒。2 pCH-S-hRLuc和pCH-M5-hRLuc的构建在pCH-S-GFP和pCH-M5-GFP质粒S基因区,以hRLuc替换GFP,构建pCH-S-hRLuc和pCH-M5-hRLuc两个质粒。3外源基因的表达能力的检测HBV载体经基因改造后,通过质粒共转染肝细胞,应用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,应用荧光素酶检测试剂盒检测海肾荧光素酶的表达水平,鉴定新构建质粒pCH-M5-GFP、pCH-S-hrLuc和pCH-M5-hrLuc的外源基因的表达能力。4重组HBV复制能力的检测。与辅助质粒共转染后,提取细胞裂解液中的HBVDNA,Sorthern blot技术检测重组HBV复制能力。5重组HBV感染树鼩肝细胞能力的检测。原代培养树鼩肝细胞,感染浓缩的重组HBV颗粒1W后,观察细胞内GFP的表达水平。结果:1成功构建了不能表达HBV结构基因的新型HBV载体。2新型HBV载体外源基因的表达水平基因突变后表达GFP的质粒转染肝癌细胞系后,GFP表达水平明显强于原始质粒。3通过southern blot检测,在细胞裂解液中能够形成HBV复制中间体。4重组HBV感染树鼩肝细胞1W后,能够观察到GFP。结论:HBV载体通过变更起始密码子和终止密码子后,阻断结构基因表达,在S基因区插入报告基因GFP和hrLUC,构建了新质粒,其外源基因的表达水平高于对照原始载体质粒,能够形成HBV DNA复制中间体,而且形成的重组HBV能够感染树鼩肝细胞。第二部分新型HBV载体应用一:持续分泌表达BsdR的重组HBV细胞系的构建目的:构建一个持续分泌重组HBV的细胞系,该重组HBV表达杀稻瘟菌素抗性基因（BsdR）。方法:1构建具有G418抗性的无包装信号的HBV辅助质粒pcDNA3.1-CH3142与表达BsdR的HBV载体质粒。2上述2个质粒共转染HepG2细胞,经G418和杀稻瘟菌素共筛选,获得阳性细胞克隆。3经过ELISA和斑点杂交技术筛选出高分泌重组HBV-Bsd颗粒的细胞系。4 G418反复加压培养,Southern blot和Native Western blot技术,再次筛选,获得高表达Bsd的重组HBV的细胞系,并通过PCR技术检测重组HBV的表达水平。5应用PCR技术,对野生型HBV和重组HBV进行鉴定,证实所构建细胞系无野生型HBV形成。6应用免疫电镜技术观察到完整的有囊膜包被的重组HBV颗粒。结果:1转染后,经G418筛选后,获得50余个细胞克隆。2挑选其中36个进行扩增,经同位素标记探针斑点杂交法检测细胞上清液中HBV DNA,选取9个表达量较高者。3继续传代培养15代（约3个月）,检测其形成疏松环状DNA的能力,最终选定HBV-Bsd25,HBV-Bsd7,HBV-Bsd27三个细胞株。4细胞培养上清液中HBV DNA定量分别为4.1×106、3.6×106、1.2×106copies/mL。5未检测到野生型HBV的产生。6 HBV-Bsd25细胞培养上清液经PEG8000浓缩后进行氯化铯密度梯度离心,分段进行Southern Blot及Western Blot检测,观察到完整有囊膜包被的重组HBV颗粒形成。7电镜观察有完整的HBV颗粒。结论:成功构建稳定表达BsdR重组HBV的细胞系,实现了大量制备重组HBV载体,有助于HBV载体用于HBV易感细胞系的筛选。第三部分新型HBV载体质粒应用二:腺病毒-HBV嵌合载体表达胶原酶II抗肝硬化研究一、腺病毒-HBV嵌合载体的构建与表达目的构建表达MMP8、tMMP8、RFP2的HBV载体,再利用复制缺损型腺病毒载体进行包装,构建Ad-CH-tMMP8、Ad-C-MMP8、Ad-CH-RFP2三个质粒。观察细胞内tMMP8 mRNA和RFP的表达情况,证明目的基因的表达能力,及其启动子的嗜肝特异性。方法:1应用PCR技术和酶切重组技术构建表达MMP8、tMMP8、RFP2的HBV载体,经过酶切鉴定和测序鉴定正确后,再利用复制缺损型腺病毒载体进行包装,构建Ad-CH-tMMP8、Ad-C-MMP8、Ad-CH-RFP2三个质粒。2 PCR技术证实重组腺病毒载体正确性,获得理想基因片段。3正确后,进行大量提取,纯化,浓度测定,感染293细胞,进行空斑形成能力的检测。4肝细胞感染重组腺病毒后,观察细胞内MMP8及tMMP8 mRNA的表达情况,应用荧光显微镜RFP的表达情况.5 HBV载体在血管上皮细胞（ECV304）中低表达:以CMV启动子及HBVS启动子驱动的GFP质粒,转染血管上皮细胞及肝癌细胞,分别观察其GFP的表达。结果:1成功构建了表达不同目的基因的腺病毒-HBV嵌合载体质粒。2携带MMP8和tMMP8的重组腺病毒感染肝细胞后表达tMMP8。携带RFP2的重组腺病毒感染肝细胞后表达红色荧光。3不同启动子驱动的GFP质粒转染不同细胞后,在HepG2和ECV304的表达水平存在差异。结论:表达不同目的基因的腺病毒载体-HBV嵌合载体能够被成功构建。该载体转染肝癌细胞后,能够成功表达各种目的基因;重组腺病毒载体携带MMP8基因的质粒感染HepG2后,其细胞中存在MMP8 mRNA的表达,应用荧光显微镜可以观察到红色荧光蛋白;HBV载体s启动子驱使的GFP在ECV304中低表达,在HepG2呈现高表达。而CMV启动子驱使的GFP在ECV304和HepG2均呈现高表达,提示S启动子的载体质粒对肝癌细胞系有一定特异性。二、硫代乙酰胺诱导的大鼠肝硬化模型的实验研究目的观察TAA制备大鼠肝硬化模型前后,肝脏组织学及血清学指标的变化情况,HGF/C-met系统在肝硬化发生和转归过程中的表达水平,为腺病病毒-HBV前忽而载体表达胶原酶II在肝硬化的实验研究奠定基础。方法: 42只雄性Wistar大鼠应用硫代乙酰胺饮用水喂养,制备肝硬化模型。模型制备成功后,随机分为7组,每组6只。每隔2周处死一组大鼠,留取血清检测肝功能,并检测肝组织中羟脯氨酸含量,进行HE和天狼猩红染色,同时RT-PCR技术检测HGF及其受体c-Met,另以正常大鼠6只为对照。结果:HGF/c-Met mRNA表达显著高于正常对照组,随着停止应用TAA时间的延长,肝功能、组织学改变、羟脯氨酸含量及HGF/c-Met的mRNA表达水平均逐渐恢复。结论:应用TAA20周成功诱导了肝硬化模型;停止TAA后,肝组织学、肝功能和肝脏的羟脯氨酸均有不同程度的自愈趋势。肝脏组织学的好转晚于肝功能的变化。在肝组织自愈的的同时,HGF及其受体c-Met的表达水平均有不同程度的下降趋势,但各组之间无统计学差异。三、腺病毒-HBV嵌合载体表达胶原酶Ⅱ治疗肝硬化的实验研究目的通过利用腺病毒-HBV嵌合载体,表达胶原酶Ⅱ,治疗肝硬化大鼠模型,探讨其能否有效地降解Ⅰ型胶原,促进肝细胞再生,改善肝功能,逆转肝硬化。方法:1模型制备应用0.3%硫代乙酰胺饮用水诱导的方法,制备大鼠肝硬化模型。2分组给药120只肝硬化模型大鼠随机分四组,每组30只,分别给予Ad-CH-tMMP8、Ad-C-MMP8、Ad-CH-RFP2三种重组腺病毒尾静脉注射,以1.5×1011VP/Kg剂量,一次给药。另外留取30只大鼠作为正常对照组,给予正常应用水喂养。3标本留取分别于2W、4W、8W后颈椎脱髓法处死动物。分离血清,-20℃保存;留取肝组织,少部分用10%的福尔马林固定,进行组织病理学检查,余者无菌条件下保存在液氮中。4指标检测全自动生化分析仪检测肝功能、放射免疫法检测肝硬化指标。胃酸酶解法检测肝组织羟脯氨酸含量。HE、天狼星红染色、免疫组化的方法观察肝脏组织病理学改变,并进行Knodel评分和一型胶原所占面积百分比进行半定量分析。RT-PCR方法检测肝组织内MMP8、HGF、c-Met和GAPDH。5统计分析应用SAS统计分析软件,进行统计处理。结果:1 Ad-HBV嵌合载体对肝硬化大鼠模型MMP8 mRNA表达水平的影响治疗组大鼠肝脏能够表达MMP8,但对照组没有检测到MMP8 mRNA表达,而且随着停药时间的延长,其表达水平呈下降趋势,直到第12W仍有少量表达。2 Ad-HBV嵌合体对肝硬化大鼠模型肝功能的影响在第2W、第4W时,与两个对照组相比,各治疗组ALT均有明显下降,具有统计学意义（P<0.05）。第8周,治疗组肝功能接近正常组。3 Ad-HBV嵌合体对肝硬化大鼠模型肝纤维化指标的影响与两个对照组相比,各治疗组HA和LN均有明显下降,具有统计学意义（P<0.05）。在治疗第8W时,治疗组HA和LN接近正常组。4 Ad-HBV嵌合体对大鼠肝硬化模型肝组织学的影响与对照组相比,治疗组病理学改善较快,炎症细胞浸润及纤维组织增生明显减轻,肝小叶结构破坏减轻,有肝细胞再生现象。5 Ad-HBV嵌合体对大鼠肝硬化模型肝组织羟脯氨酸含量的影响羟脯氨酸是胶原和弹性蛋白水解后产生的的一种氨基酸,约占胶原重量14%,其他蛋白质中罕见。羟脯氨酸的含量也随着肝硬化的严重程度而改变,在应用腺病毒治疗2W时,肝组织内羟脯氨酸含量明显低于对照组。6 Ad-HBV嵌合体在大鼠肝硬化模型HGF/c-Met mRNA的表达与两个对照组相比,各治疗组HGF/cMet mRNA均有明显升高,具有统计学意义（P<0.05）。第8周,治疗组肝组织HGF/c-Met mRNA接近正常组。结论:应用重组腺病毒治疗大鼠肝硬化模型后,肝功能好转,肝组织学及肝组织内的羟脯胺酸明显改善,肝组织表达MMP8,能够有效地降解Ⅰ型胶原,肝硬化减轻,肝细胞再生。HGF/c-Met mRNA表达水平增加。这一创新,有望把MMP-8基因治疗肝硬化带入临床应用,开辟肝硬化软肝治疗新途径。