鸡△6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及其在不同组织中的表达

论文摘要

多不饱和脂肪酸（PUFA）在机体内具有一系列重要的生理功能。Δ6-脂肪酸脱氢酶则是形成多不饱和脂肪酸的限速酶。基于Δ6-脂肪酸脱氢酶在多不饱和脂肪酸形成过程中的重要作用,本实验开展了对固始鸡Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的研究工作。本实验通过两次RT-PCR和一次3,RACE,获得了全长为2141bp的cDNA,该cDNA具有一个长度为1335bp、编码443个氨基酸的开放阅读框。这是Δ6-脂肪酸脱氢酶基因首次在鸡上的成功克隆。以得到的鸡的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因序列为搜索对象,通过Contig分析,获得了鸡Δ6-脂肪酸脱氢酶基因编码序列的内含子和外显子边界,序列分析表明该基因含有12个外显子和11个内含子。通过半定量PCR,比较脂肪酸脱氢酶在不同组织中的表达,发现在肝脏中表达量最大。该试验为进一步研究该基因在脂肪酸形成过程中的作用奠定了基础。本研究共分两个部分:试验一Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆1Δ6-脂肪酸脱氢酶基因部分编码序列的克隆根据GenBank上预测的鸡的Δ6-脂肪酸脱氢酶基因序列XM421053设计引物,进行RT-PCR,扩增出一个长度为1323bp的片段（D6D1）。该序列与人、大鼠、小鼠、牛等动物的核苷酸同源性达到74%以上。2Δ6-脂肪酸脱氢酶基因5,端的克隆将已获得的部分编码序列作为搜索对象,在NCBI网站进行Blast,获得了一段鸡EST（BI390105）。该序列与上述克隆的部分编码序列的5,端有一部分重复序列。根据该EST设计基因特异性引物进行5,端的扩增。获得了一个283bp的片段（D6D2）。该片段与部分编码序列有99bp的重叠区,表明所得到的片段为同一基因的部分序列。3、Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的3,UTR的克隆为了获得固始鸡Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的3,非翻译区端,根据所获得的部分编码序列设计基因特异性引物,利用3,RACE试剂盒进行3,末端cDNA的扩增,得到一个706bp的片段（D6D3）。该片段与部分编码序列的3,端有36bp的重叠区。通过DNAMAN将三个克隆片段连接,得到了2141bp的cDNA全长。试验二、利用半定量PCR检测鸡△6-脂肪酸脱氢酶在不同组织中的表达为了检测△6-脂肪酸脱氢酶在不同组织中的表达,利用半定量PCR检测△6-脂肪酸脱氢酶在肝脏、心脏、肺脏等组织中的mRNA的相对含量。结果表明,肝脏、脾脏、胰脏、肺脏中的Δ6-脂肪酸脱氢酶mRNA相对含量差异不显著;肝脏显著高于胸肌;胸肌、心脏和腹脂的差异不显著;肺脏显著高于腹脂。而Δ6-脂肪酸脱氢酶在肌胃中未见有表达。鸡Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及在不同组织中的表达为进一步研究Δ6-脂肪酸脱氢酶在多不饱和脂肪酸的形成过程中的作用奠定了一定的基础。

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 1 文献综述
• 1.1 脂肪酸的命名
• 1.2 脂肪酸的分类
• 1.3 多不饱和脂肪酸的营养功能
• 1.3.1 对生长发育的作用
• 1.3.2 对脂类代谢的影响
• 1.3.3 对细胞膜功能的影响
• 1.3.4 对炎症反应及免疫机能的影响
• 1.3.5 对基因表达的调控
• 1.3.6 对肿瘤的抑制作用
• 1.3.7 与心血管疾病的关系
• 1.4 鸡脂肪酸与肉品风味
• 1.5 动物体内多不饱和脂肪酸合成的途径
• 1.6 脂肪酸脱氢酶
• 1.7 Δ6-脂肪酸脱氢酶的研究进展
• 6-脂肪酸脱氢酶基因'>1.7.1 Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因
• 6-脂肪酸脱氢酶的结构'>1.7.2 Δ⁶-脂肪酸脱氢酶的结构
• 6-脂肪酸脱氢酶的作用'>1.7.3 Δ⁶-脂肪酸脱氢酶的作用
• 1.7.3.1 将18-C 和24-C 脱氢
• 1.7.3.2 将16-C 脱氢
• 6-脂肪酸脱氢酶基因的表达'>1.7.4 Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因的表达
• 6-脂肪酸脱氢酶基因在不同组织达'>1.7.4.1 Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因在不同组织达
• 6-脂肪酸脱氢酶基因在不同时期的表达'>1.7.4.2 Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因在不同时期的表达
• 6-脂肪酸脱氢酶的基因表达和活性的影响'>1.7.4.3 基因和食物对Δ⁶-脂肪酸脱氢酶的基因表达和活性的影响
• 1.8 RACE（Rapid apliaction of cDNA Ends）技术
• 1.8.1 5,RACE 技术
• 1.8.2 3，RACE 技术
• 1.9 研究的目的和意义
• 2 引言
• 6-脂肪酸脱氢酶基因cDNA的克隆及序列分析'>3 鸡Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因cDNA的克隆及序列分析
• 3.1 材料
• 3.2 方法
• 3.2.1 部分编码序列的扩增
• 3.2.1.1 PCR引物的设计与合成
• 3.2.1.2 肝脏总RNA的提取
• 3.2.1.3 RT反应
• 3.2.1.4 PCR 反应
• 3.2.1.5 PCR产物的回收和纯化
• 3.2.1.6 PCR产物与pUCm-T载体的连接
• 3.2.1.7 连接液的转化
• 3.2.1.8 转化菌的筛选与鉴定
• 3.2.1.9 测序
• 6-脂肪酸脱氢酶基因5，端的扩增'>3.2.2 Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因5，端的扩增
• 3.2.2.1 PCR引物的设计与合成
• 3.2.2.2 肝脏总RNA 提取
• 3.2.2.3 反转录合成第一链cDNA
• 3.2.2.4 PCR反应
• 3.2.2.5 PCR 产物回收和克隆测序
• 6-脂肪酸脱氢酶基因3，UTR 的扩增'>3.2.3 Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因3，UTR 的扩增
• 3.2.3.1 肝脏总RNA 提取
• 3.2.3.2 引物设计与合成
• 3.2.3.3 反转录反应
• 3.2.3.4 套式PCR 反应
• 3.2.3.5 Inner PCR 反应
• 3.2.3.6 PCR 产物回收和克隆测序
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 部分编码序列的扩增结果
• 3.3.1.1 从鸡肝脏中提取的RNA 鉴定结果
• 3.3.1.2 RT-PCR 结果
• 3.3.1.3 重组质粒的鉴定
• 3.3.1.4 质粒PCR 鉴定
• 3.3.1.5 酶切鉴定
• 3.3.1.6 重组质粒的序列测定结果
• 6-脂肪酸脱氢酶基因序列的对比'>3.3.1.7 与预测的鸡的Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因序列的对比
• 3.3.1.8 核苷酸序列同源性分析
• 3.3.1.9 氨基酸同源性分析
• 6-脂肪酸脱氢酶基因5’端的扩增结果'>3.3.2 Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因5’端的扩增结果
• 3.3.2.1 RT-PCR结果
• 3.3.2.2 重组质粒的鉴定
• 3.3.2.3 质粒PCR 鉴定
• 6-脂肪酸脱氢酶基因5’端的测序结果'> 3.3.2.4 Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因5’端的测序结果
• 6-脂肪酸脱氢酶基因3’UTR的扩增结果'>3.3.3 Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因3’UTR的扩增结果
• 3.3.3.1 RT-PCR结果
• 3.3.3.2 重组质粒的鉴定
• 3.3.3.3 质粒PCR 鉴定
• 3.3.3.4 酶切鉴定
• 6-脂肪酸脱氢酶基因3’UTR的测序结果'>3.3.3.5 Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因3’UTR的测序结果
• 6-脂肪酸脱氢酶基因的序列分析'>3.3.4 Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因的序列分析
• 6-脂肪酸脱氢酶基因的核苷酸序列分析'>3.3.4.1 Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因的核苷酸序列分析
• 6-脂肪酸脱氢酶的氨基酸序列及结构分析'>3.3.4.2 Δ⁶-脂肪酸脱氢酶的氨基酸序列及结构分析
• 3.4 结论与讨论
• 6-脂肪酸脱氢酶的研究现状'>3.4.1 鸡Δ⁶-脂肪酸脱氢酶的研究现状
• 3.4.2 总RNA的提取
• 3.4.3 引物的设计和RT-PCR扩增
• 6-脂肪酸脱氢酶序列与结构分析'>3.4.4 △⁶-脂肪酸脱氢酶序列与结构分析
• 6-脂肪酸脱氢酶在不同组织中的表达'>4 利用半定量PCR检测鸡△⁶-脂肪酸脱氢酶在不同组织中的表达
• 4.1 试验材料
• 4.2 方法
• 4.2.1 PCR引物设计与合成
• 4.2.2 提取各个组织中的总RNA
• 4.2.3 RNA浓度的测定
• 4.2.4 RNA的纯
• 4.2.5 反转录反应
• 4.2.6 PCR 反应
• 4.2.7 PCR 纯化产物测序
• 4.2.8 琼脂糖电泳
• 4.2.9 统计分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 RT-PCR 的电泳结果
• 4.3.2 测序结果
• 6-脂肪酸脱氢酶mRNA 相对含量的比'>4.3.3 固始鸡不同组织Δ⁶-脂肪酸脱氢酶mRNA 相对含量的比
• 4.4 结论与讨论
• 4.4.1 半定量PCR
• 4.4.2 PCR引物的设计
• 6-脂肪酸脱氢酶基因在不同组织中的表达'>4.4.3 Δ⁶-脂肪酸脱氢酶基因在不同组织中的表达
• 5 总结
• 参考文献
• ABSTRACT