本文主要研究内容
作者刘晓华,邓凯,范威宏,黄永军,杜姗姗,冯万有,潘尔科,卢嘉卡,文冬梅,陆凤花,石德顺（2019）在《水牛asf1a基因克隆及高效敲除靶位点的筛选》一文中研究指出：本研究旨在对水牛anti-silence factor 1a (asf1a)基因进行克隆并行生物信息学分析,并进一步筛选基于CRISPR/Cas9基因编辑系统的高效敲除asf1a基因位点。根据NCBI公布的牛asf1a基因mRNA序列设计特异性引物,以水牛GV期卵母细胞RNA反转录后的cDNA作为模板,通过PCR技术克隆获得asf1a基因序列片段,利用生物信息学分析方法,对克隆得到的序列进行和相应翻译的蛋白质进行了分析。在克隆得到的水牛asf1a基因序列上筛选3个PAM位点,并根据PAM位点构建3个gRNA载体(g1、g2、g3)以及相应的RGS载体,将pcDNA3.1-h Cas9连同gRNA、RGS 3种质粒按照3∶1∶1比例共转293T细胞,筛选高效的CRISPR/Cas9敲除位点。试验以水牛GV期的卵母细胞RNA作为模板,通过RT-PCR技术克隆获得asf1a基因序列,并据测序结果设计靶向区域筛选高效asf1a基因敲除位点。结果发现,水牛asf1a基因CDS区全长615 bp,编码204个氨基酸;多重序列分析显示,水牛asf1a基因核苷酸序列与黄牛、绵羊、猪、人、小鼠同源性分别达到了99%,98%,97%,96%,93%;蛋白质结构预测分析发现存在ASF1-hist-chap等结构,二级结构含有9个α螺旋、12个β折叠、14个T转角、14个无规则卷曲。系统进化树分析表明,水牛和黄牛亲缘性最接近。根据水牛asf1a设计的敲除载体转染293T和成纤维细胞后,细胞基因组进行T7E1酶切的结果表明,g1位点对水牛成纤维细胞敲除效率最高,达到93.82%,同时,sanger测序表明效率达17/20。本研究成功克隆了水牛asf1a基因和分析了其生物学信息,同时筛选出了asf1a的高效敲除位点,为研究水牛asf1a基因功能奠定基础。
Abstract
ben yan jiu zhi zai dui shui niu anti-silence factor 1a (asf1a)ji yin jin hang ke long bing hang sheng wu xin xi xue fen xi ,bing jin yi bu shai shua ji yu CRISPR/Cas9ji yin bian ji ji tong de gao xiao qiao chu asf1aji yin wei dian 。gen ju NCBIgong bu de niu asf1aji yin mRNAxu lie she ji te yi xing yin wu ,yi shui niu GVji luan mu xi bao RNAfan zhuai lu hou de cDNAzuo wei mo ban ,tong guo PCRji shu ke long huo de asf1aji yin xu lie pian duan ,li yong sheng wu xin xi xue fen xi fang fa ,dui ke long de dao de xu lie jin hang he xiang ying fan yi de dan bai zhi jin hang le fen xi 。zai ke long de dao de shui niu asf1aji yin xu lie shang shai shua 3ge PAMwei dian ,bing gen ju PAMwei dian gou jian 3ge gRNAzai ti (g1、g2、g3)yi ji xiang ying de RGSzai ti ,jiang pcDNA3.1-h Cas9lian tong gRNA、RGS 3chong zhi li an zhao 3∶1∶1bi li gong zhuai 293Txi bao ,shai shua gao xiao de CRISPR/Cas9qiao chu wei dian 。shi yan yi shui niu GVji de luan mu xi bao RNAzuo wei mo ban ,tong guo RT-PCRji shu ke long huo de asf1aji yin xu lie ,bing ju ce xu jie guo she ji ba xiang ou yu shai shua gao xiao asf1aji yin qiao chu wei dian 。jie guo fa xian ,shui niu asf1aji yin CDSou quan chang 615 bp,bian ma 204ge an ji suan ;duo chong xu lie fen xi xian shi ,shui niu asf1aji yin he gan suan xu lie yu huang niu 、mian yang 、zhu 、ren 、xiao shu tong yuan xing fen bie da dao le 99%,98%,97%,96%,93%;dan bai zhi jie gou yu ce fen xi fa xian cun zai ASF1-hist-chapdeng jie gou ,er ji jie gou han you 9ge αluo xuan 、12ge βshe die 、14ge Tzhuai jiao 、14ge mo gui ze juan qu 。ji tong jin hua shu fen xi biao ming ,shui niu he huang niu qin yuan xing zui jie jin 。gen ju shui niu asf1ashe ji de qiao chu zai ti zhuai ran 293The cheng qian wei xi bao hou ,xi bao ji yin zu jin hang T7E1mei qie de jie guo biao ming ,g1wei dian dui shui niu cheng qian wei xi bao qiao chu xiao lv zui gao ,da dao 93.82%,tong shi ,sangerce xu biao ming xiao lv da 17/20。ben yan jiu cheng gong ke long le shui niu asf1aji yin he fen xi le ji sheng wu xue xin xi ,tong shi shai shua chu le asf1ade gao xiao qiao chu wei dian ,wei yan jiu shui niu asf1aji yin gong neng dian ding ji chu 。
论文参考文献
论文详细介绍
论文作者分别是来自中国兽医学报的刘晓华,邓凯,范威宏,黄永军,杜姗姗,冯万有,潘尔科,卢嘉卡,文冬梅,陆凤花,石德顺，发表于刊物中国兽医学报2019年03期论文，是一篇关于水牛论文,克隆论文,敲除论文,中国兽医学报2019年03期论文的文章。本文可供学术参考使用，各位学者可以免费参考阅读下载，文章观点不代表本站观点，资料来自中国兽医学报2019年03期论文网站，若本站收录的文献无意侵犯了您的著作版权，请联系我们删除。
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