蒙古绵羊β-防御素-1的表达、纯化及生物学功能研究

论文摘要

背景:抗菌肽是构成先天性免疫的重要组成物质。β-防御素是一种含有6个半胱氨酸残基,前原肽由64个氨基酸构成的一种阳离子多肽。主要存在于动物的上皮组织中。防御素的成熟肽形式其分子量为3.5～6 kDa,富含精氨酸,富含阳离子。它可以对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和病毒等产生抑制作用。目的:寻找绵羊β-防御素-1（sBD-1）的活性区域且建立可以通过基因工程的方法得到有生物活性的、大量的、易纯化的绵羊sBD-1的方法。方法:含sBD-1信号肽序列的前原肽（psBD-1）和不含信号肽的sBD-1（msBD-1）在大肠杆菌BL21（DE3）表达,而后将表达产物通过金属螯合层析,肠激酶切,脱盐和冷冻干燥后,将其作用于大肠杆菌。得到了sBD-1的活性区域msBD-1。而后又分别构建了Ppic9k-msBD-1和在其C末端加6个组氨酸标签的Ppic9k-msBD-1-T的巴斯德毕赤酵母表达载体。进行了甲醇诱导表达,并对其表达的时间,培养基的pH,OD600和甲醇的浓度进行了优化,之后将其进行了大规模的发酵罐表达。将发酵后的发酵液进行了纯化。而后msBD-1和msBD-1-T进行了生物学功能鉴定。分别对大肠杆菌（Escherichia coli,E. coli） CMCC 44101,金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus,S. aureus） CMCC 26003,变形杆菌（Proteusbacillus vulgaris,P.vulgaris） CMCC 49001,绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa,P. aeruginosa） CMCC 10102,和痢疾杆菌（Shigella flexneri,S. flexneri） CMCC 51285进行了抑菌圈的比较。并且进行了msBD-1和msBD-1-T对Hek293细胞中CCR6-CCL20通路的影响以及对Hek293细胞的趋化移动作了研究。结果:通过原核表达,得到了msBD-1为绵羊sBD-1的活性区域。而后在毕来酵母表达,msBD-1和msBD-1-T在诱导24 h时,培养基pH为4.4,甲醇浓度为4%时它们的表达量最高。之而又进行了大规模的发酵罐表达。表达后Ppic9k-msBD-1-T通过金属螯合层析,Sepdex-G10和冷冻干燥后获得。而Ppic9k-msBD-1则通过不同pH的磷酸缓冲液-阳离子交换层析,分子筛和冷冻干燥获得。之后进行了抑菌实验,得到msBD-1和msBD-1-T对E. coli, S. aureus, P. vulgaris, P. aeruginosa和S. flexneri均有抑制作用。而在化学诱导实验中,msBD-1和msBD-1-T均可使Hek293细胞作定向移动,并且可诱导CCR6的表达量增加,而CCL20无变化。结论:1.蒙古绵羊β-防御素-1的抗菌活性是在细胞内经胞质内相关酶的加工后分泌到胞外发挥其生物学功能。2.成功构建了巴斯德毕赤酵母表达载体Ppic9k-msBD-1和Ppic9k-msBD-1-T,将其转入巴斯德毕赤酵母GS115中。并成功的将巴斯德毕赤酵母表达系统由摇瓶水平扩大至发酵罐水平,为进一步的进行大规模的生产奠定了基础。3.建立了msBD-1和msBD-1-T的纯化系统。尤其是msBD-1的纯化,这为进一步大规模获得成熟绵羊β-防御素-1提供了实验室基础。4. msBD-1和msBD-1-T均具有抑制细菌生长的作用,说明在防御素的C未端加6个HIS标签对防御素抗菌作用没有影响,由于HIS标签是带正电荷的氨基酸残基,因此还增强了msBD-1的抗菌活性。同时msBD-1和msBD-1-T均具有化学诱导功能。它们可诱导人胚胎肾细胞中CCL20的配体CCR6的表达量升高。同时也可以使人胚胎肾细胞作定向移动。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 动物抗菌肽简介
• 1.1.1 动物防御素的分类
• 1.1.2 动物防御素的分子特征
• 1.1.3 动物防御素的分布
• 1.2 动物β-防御素的特点
• 1.2.1 动物β-防御素的一级结构
• 1.2.2 动物β-防御素的分布
• 1.3 动物β-防御素的抑菌功能
• 1.3.1 动物β-防御素抑菌活性
• 1.3.2 动物β-防御素的抑菌机制
• 1.4 动物β-防御素的其它生物活性
• 1.4.1 动物β-防御素的免疫调节作用
• 1.4.2 动物β-防御素细胞毒作用
• 1.4.3 动物β-防御素对癌细胞的作用
• 1.5 防御素的应用前景
• 1.5.1 代替部分抗生素，从而为解决细菌耐药性问题提供新的方法
• 1.5.2 应用于动物转基因工程
• 1.5.3 应用于农业生产
• 1.6 本研究的目的意义
• 2 实验一 蒙古绵羊β-防御素-1（sBD-1）的cDNA 的克隆与序列分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 载体、菌种
• 2.1.2 仪器和试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 PCR 引物的设计及合成
• 2.2.2 蒙古绵羊十二指肠组织 RNA 的提取及检测
• 2.2.3 RT-PCR 反应
• 2.2.4 sBD-1 基因cDNA 的克隆及重组质粒的筛选和鉴定
• 2.2.5 RT-PCR 产物cDNA 的序列测定
• 2.3 结果
• 2.3.1 十二指肠组织总 RNA 的检测结果
• 2.3.2 十二指肠组织 RT-PCR 扩增结果
• 2.3.3 sBD-1 基因的克隆与鉴定
• 2.3.4 测序结果及序列分析
• 2.3.5 蒙古绵sBD-1 与牛、羊、猪β-防御素氨基酸序列的比较
• 2.4 讨论
• 3 实验二 蒙古绵羊β-防御素前原肽及其成熟肽在大肠杆菌中的表达
• 3.1 材料
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 sBD-1 前原肽及其成熟肽重组原核表达载体的构建
• 3.2.2 PET32a-psBD-1 和 PET32a-msBD-1 重组原核表达载体的表达
• 3.2.3 表达蛋白的纯化（亲和层析）
• 3.2.4 更换酶切缓冲液
• 3.2.5 肠激酶酶切
• 3.2.6 脱盐
• 3.2.7 冷冻干燥
• 3.2.8 Trcine-甘油-SDS-PAGE 电泳
• 3.2.9 大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌试验
• 3.3 结果
• 3.3.1 目的片段的亚克隆
• 3.3.2 PET32a-psBD-1 和 PET32a-msBD-1 的鉴定
• 3.3.3 表达蛋白的SDS-PAGE 电泳
• 3.3.4 表达蛋白的 Western blot 鉴定
• 3.3.5 表达蛋白的纯化
• 3.3.6 纯化蛋白的酶切及浓缩
• 3.3.7 重组表达的psBD-1 和msBD-1 活性鉴定
• 3.4 讨论
• 4 实验三 msBD-1 巴斯德巴斯德毕赤酵母表达中的表达
• 4.1 材料
• 4.1.1 主要材料
• 4.1.2 主要培养基
• 4.2 试验方法
• 4.2.1 编码成熟肽msBD-1 的亚克隆
• 4.2.2 重组表达质粒 Ppic9k-msBD-1/ Ppic9k-msBD-1-T 的构建及鉴定
• 4.2.3 msBD-1/msBD-1-T 的线性化
• 4.2.4 msBD-1/msBD-1-T 转入巴斯德毕赤酵母
• 4.2.5 筛选Mut+及Muts 转化子
• 4.2.6 Mut+胞内或分泌表达
• 4.2.7 Tricine-甘油-SDS-PAGE 电泳和Western Blot 检测
• 4.3 结果
• 4.3.1 编码成熟肽msBD-1 和msBD-1-T 的亚克隆
• 4.3.2 重组表达质粒 Ppic9k-msBD-1/ Ppic9k-msBD-1-T 的构建及鉴定
• 4.3.3 筛选Mut+及Muts 转化子
• 4.3.4 Tricine-甘油-SDS-PAGE 电泳和Western Blot 检测
• 4.4 讨论
• 5 实验四 Ppic9k-msBD-1/ Ppic9k-msBD-1-T 在毕赤酵母中表达条件的优化
• 5.1 材料
• 5.2 方法
• 5.2.1 最佳诱导时间的选择
• 5.2.2 最佳诱导pH 值的选择
• 5.2.3 最佳诱导甲醇浓度的选择
• 5.2.4 Tricine-甘油-SDS-PAGE 电泳
• 5.3 结果
• 5.3.1 最佳诱导时间
• 5.3.2 最佳诱导pH 值
• 5.3.3 最佳诱导甲醇浓度
• 5.4 讨论
• 6 实验五 Ppic9k-msBD-1/ Ppic9k-msBD-1-T 在发酵罐水平的表达及其纯化
• 6.1 材料
• 6.1.1 主要仪器
• 6.1.2 主要试剂
• 6.2 方法
• 6.2.1 种子液的制备
• 6.2.2 发酵罐使用前的灭菌
• 6.2.3 接种
• 6.2.4 发酵
• 6.2.5 发酵产物的纯化
• 6.2.6 表达产物的Trcine-甘油-SDS-PAGE 电泳
• 6.3 结果
• 6.3.1 发酵液上清的电泳
• 6.3.2 Ppic9k-msBD-1/ Ppic9k-msBD-1-T 在发酵罐水平表达产物的纯化
• 6.4 讨论
• 7 实验六 msBD-1 和msBD-1-T 的活性鉴定及比较
• 7.1 材料
• 7.2 方法
• 7.2.1 msBD-1 和msBD-1-T 的抗菌活性
• 7.2.2 msBD-1 和msBD-1-T 的免疫诱导作用
• 7.3 结果
• 7.3.1 msBD-1 和msBD-1-T 的抗菌活性
• 7.3.2 msBD-1 和msBD-1-T 对293T 细胞CCR6 和 CCL20 表达量的调节作用
• 7.3.3 msBD-1 和msBD-1-T 对293T 细胞的免疫趋化作用
• 7.4 讨论
• 7.4.1 绵羊防御素的抗菌活性
• 7.4.2 绵羊防御素的化学诱导活性
• 8 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介