乳糖酶产生菌的分离、鉴定及其基因克隆的研究

论文摘要

β-半乳糖苷酶（β-D-半乳糖苷半乳糖水解酶，β-D-galactoside galatohydrolase，EC3．2．1．23）通常被称为乳糖酶（Lactase）。该酶能将乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，并具有半乳糖苷的转移作用。目前，我国许多成年人和儿童是乳糖缺乏症患者，他们体内缺乏乳糖酶或乳糖酶活性很低。随着社会的向前发展，牛奶逐渐成为人们的主要食品之一，但牛奶中乳糖含量较高，这将制约牛奶的食用量，因此，利用乳糖酶生产低乳糖乳及乳制品是解决乳糖不耐受症问题的最佳途径，具有重要的实践价值和理论意义。本论文从新疆火焰山土壤中筛选出两株具有胞外乳糖酶活性的菌株，利用分子生物学方法分别对两株菌株进行鉴定，同时克隆了Huob的乳糖酶基因，并在大肠杆菌BL21中进行了表达。研究内容及结果如下：1．产乳糖酶菌株的筛选从新疆火焰山土壤中筛选出的两株菌株分别为Huoa、Huob，并且确立了酶活力测定方法和标准曲线，绘制了在摇床水中菌株Huoa和菌株Huob的酶活生长过程曲线。确定了原始菌株Huoa酶活性最高为0.074 U／mL，菌株Huob酶活性最高达到为0.415 U／mL。并且通过结晶紫染色后利用光学显微镜观察了两种菌的形态。2．产乳糖酶菌株的分子生物鉴定通过细菌16srDNA通用引物对两株菌体进行PCR扩增其对应序列，然后对PCR产物进行测序，在GenBank中对比分析了菌株Huoa和菌株Huob同源性较高的菌株，分析鉴定其对应两种细菌的种属。利用Dnaman软件对两种菌的16srDNA进行进化树分析，可知菌株Huoa的16srDNA与Cellulomonas variformis的16S的相似性很高可达到96％，在进化上很可能同属于一个祖先。菌株Huob的16srDNA与Bacillus megaterium的16S亲缘关系最近可达到100％，在进化上很可能同属于一个祖先。3．乳糖酶基因克隆及原核表达针对菌株Huob的16SrDNA同源性较高的乳糖酶基因设计引物，克隆其全长的β-半乳糖苷酶基因，经过测序得到乳糖酶全长3246bp和在NCBI中已发表的巨大芽孢杆菌乳糖酶相似性为99％，将此基因命名为BaMeb。然后将此基因转化到原核表达载体PET-30（a）中，构建了重组质粒，实现了β-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌BL21中的表达，表达量为7.64U／mL，相对原始菌株提高了乳糖酶的表达量。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 β-半乳糖苷酶及其分子生物学的研究进展
• 1.1.1 β-半乳糖苷酶的来源
• 1.1.2 β-半乳糖苷酶的高级结构和作用机制
• 1.1.3 不同来源的β-半乳糖苷酶的酶学性质分析
• 1.1.4 微生物来源的乳糖酶基因间同源性的比较
• 1.1.5 乳糖酶基因的表达
• 1.2 β-半乳糖苷酶的应用领域与应用前景
• 1.2.1 解决乳糖不耐受症患者食用乳制品的问题
• 1.2.2 改良乳制品
• 1.2.3 生产低聚半乳糖
• 1.3 16S rDNA寡核苷酸在细菌分类中的应用
• 1.4 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 筛选乳糖酶产生菌
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验方法
• 2.2 乳糖酶产生菌分子生物学鉴定
• 2.2.1 实验材料
• 2.2.2 实验方法
• 2.2.3 16srDNA的测序和同源性比较
• 2.3 乳糖酶基因克隆和原核表达
• 2.3.1 实验材料
• 2.3.2 实验方法
• 2.3.3 蛋白电泳的配置方法
• 3.结果与分析
• 3.1 乳糖酶菌株筛选
• 3.1.1 菌株富集培养
• 3.1.2 菌株复筛
• 3.1.3 乳糖酶活性的测定
• 3.1.4 菌株Huoa乳糖酶活性的积累变化曲线
• 3.1.5 菌株Huob乳糖酶活性的积累变化曲线
• 3.2 乳糖酶菌株的分子生物学鉴定
• 3.2.1 菌体16srDNA的PCR扩增
• 3.2.2 菌体重组质粒的酶切鉴定
• 3.2.3 不同来源菌体16srDNA的进化关系
• 3.3 乳糖酶基因的克隆与表达
• 3.3.1 乳糖酶基因的PCR扩增与克隆
• 3.3.2 乳糖酶基因组DNA及氨基酸序列分析
• 3.3.3 乳糖酶基因的原核表达
• 3.3.4 乳糖酶BaMeb基因相关的系统发育树分析
• 4 讨论
• 4.1 乳糖酶菌株的筛选
• 4.2 乳糖酶菌株的鉴定
• 4.3 乳糖酶菌株的克隆
• 4.4 乳糖酶蛋白的表达
• 4.5 本研究创新点
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间发表的学术论文