论文摘要
鱼腥草是三白草科（Saururaceae）中一种重要的药用植物,具有抗菌、消炎作用。鱼腥草素（癸酰乙醛）是其主要的抗菌有效成分。由于天然鱼腥草素在鱼腥草中含量很小,且难溶于水、化学性质不稳定,所以通常用亚硫酸氢钠修饰其醛基,得到活性不变、性质更稳定的合成鱼腥草素,并在临床上得到了广泛使用。现代药理学研究表明,合成鱼腥草素不仅具有抗菌、消炎的功效,还具有免疫调节功能。很多体内动物试验和临床使用报道显示,合成鱼腥草素能提高机体特异性和非特异性免疫功能。体外试验显示,合成鱼腥草素能够促进T淋巴细胞培养液中IL-2水平的提高;能够激活巨噬细胞,提高其吞噬能力,促进其产生酸性磷酸酶、溶菌酶等水解酶类,增强其呼吸爆发,提高细胞内游离钙离子的浓度。本文的目的是研究合成鱼腥草素同系物(HOU-C8:辛酰乙醛磺酸钠;HOU-C10:癸酰乙醛磺酸钠;HOU-C12:十二酰乙醛磺酸钠;HOU-C14:十四酰乙醛磺酸钠;HOU-C16:十六酰乙醛磺酸钠)对巨噬细胞免疫功能的影响,探究在体外试验中合成鱼腥草素同系物调节巨噬细胞免疫功能的作用与浓度和碳链长度之间的关系。首先检测了合成鱼腥草素同系物（HOU-Cn,n=8,10,12,14,16）对巨噬细胞分泌的溶菌酶活性的影响。巨噬细胞与合成鱼腥草素同系物（终浓度分别为0μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL）共培养24小时后,检测培养液中溶菌酶的比活力。然后,为了明确培养液中的合成鱼腥草素是否影响溶菌酶的活性,专门设计实验检测合成鱼腥草素同系物与溶菌酶结合后,溶菌酶活性的变化;并且还通过溶菌酶中Tyr残基和Trp残基荧光光谱的变化,来确定溶菌酶分子的空间构象是否因为合成鱼腥草素同系物的结合而发生了变化。酸性磷酸酶在巨噬细胞的溶酶体中发挥作用,降解通过吞噬作用进入细胞的抗原。巨噬细胞溶酶体中的酸性磷酸酶是耐酒石酸的酸性磷酸酶（TRAP）。巨噬细胞与合成鱼腥草素同系物（终浓度分别为0μg/mL、0.50μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、4.0μg/mL、8.0μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、64μg/mL）共培养24小时后,用新鲜的10%NBS RPMI-1640培养液洗涤3次,然后加入该培养液,反复冻融3次裂解细胞,检测细胞裂解后上清液中TRAP的比活力。巨噬细胞的呼吸爆发过程产生反应性氧中间物（ROI）,ROI可以在细胞内发挥作用,也可以分泌到细胞外。它们参与抗原的降解,具有杀菌、杀伤肿瘤细胞的作用。用DCFH-DA检测经不同浓度合成鱼腥草素同系物处理后巨噬细胞的呼吸爆发强度,在525nm处的荧光强度的变化可以间接显示呼吸爆发强度的变化。钙离子在细胞内多条细胞信号通路中起作用,在细胞生理过程的调控中起重要作用。不同浓度的合成鱼腥草素同系物与巨噬细胞分别在无新霉素和含1.5mmol/L新霉素的条件下相互作用,用Fura-2检测胞内游离钙离子的强度,从而确定HOU-Cn（n=8,10,12,14,16）在不同浓度下对胞内游离钙离子浓度的影响,以及新霉素对磷脂酶C（PLC）的抑制是否影响到胞内钙离子的释放。合成鱼腥草素同系物（HOU-Cn,n=8,10,12,14,16）一般在0～2.0μg/mL浓度之间均有提高巨噬细胞培养液中溶菌酶比活力的作用,同时在低于2.0μg/mL的浓度下,巨噬细胞培养液中溶菌酶水平具有随着同系物碳链的延长而上升的趋势。HOU-Cn（n=8,10,12,14,16）对溶菌酶活性有抑制作用,通过与蛋白分子的疏水结合,引起酶分子空间构象的改变,导致酶活性的丧失;这种抑制作用随着HOU-Cn（n=8,10,12,14,16）浓度的增大或碳链的延长,而逐步提高。HOU-Cn（n=8,10,12,14,16）在低浓度下促进巨噬细胞产生TRAP,在0～2.0μg/mL浓度内,TRAP比活力有随着浓度上升而提高的趋势。在较高浓度（16～64μg/mL）下,巨噬细胞产生的TRAP活性随着HOU-Cn（n=8,10,12,14,16）碳链的延长有上升的趋势。合成鱼腥草素同系物（HOU-Cn,n=8,10,12,14,16）在无外来抗原性异物（如ConA）的条件下,均能提高巨噬细胞呼吸爆发的强度,促进反应性氧中间物的产生。HOU-Cn（n=8,10,12,16）在0～16μg/mL浓度间对巨噬细胞呼吸爆发的都具有显著的促进作用,并且都有剂量依赖性。HOU-C14在0.50～64μg/mL浓度间能够使巨噬细胞的呼吸爆发强度显著高于对照组(HOU-C14的浓度是0μg/mL),但浓度的变化对呼吸爆发的影响不显著。HOU-Cn（n=8,10,12,14,16）通过活化PLC,促进IP3的产生,开启内质网上的钙离子通道,提高巨噬细胞胞内游离钙离子的浓度,IP3似乎是巨噬细胞胞内钙库释放钙离子的唯一途径。钙离子是呼吸爆发作用所必需的,细胞内钙离子浓度的上升引发了巨噬细胞呼吸爆发的增强;钙离子是多种细胞信号通路中重要的信号,可以启动一些免疫相关基因的表达。HOU-Cn（n=8,10,12,14）在0～16μg/mL的浓度范围内,随着浓度的上升或者碳链的延长,促进胞内钙离子释放的作用越强。HOU-C16促进胞内钙离子释放的作用随浓度的上升呈下降趋势,在16～64μg/mL的浓度范围内不具有促进胞内钙离子释放的作用。经过初步试验研究,合成鱼腥草素同系物HOU-Cn（n=8,10,12,14,16）能够提高巨噬细胞产生的溶菌酶和酸性磷酸酶的活性,促进降解吞噬泡中和细胞外的外源异物;上调胞内钙离子信号通路,启动表达一些免疫相关的基因,还通过胞内钙离子浓度的上升引发呼吸爆发的增强、促进ROI的产生,从而提高巨噬细胞的免疫功能。其免疫调节作用的强弱与其碳链的长短有一定规律。
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标签：合成鱼腥草素同系物论文; 巨噬细胞论文; 水解酶论文; 呼吸爆发论文; 胞内钙离子论文;