脑缺血耐受诱导过程中大鼠海马CA1区谷氨酸转运体GLT-1 mRNA的表达

论文摘要

目的谷氨酸是中枢神经系统最主要的兴奋性神经递质之一。大量研究表明,脑缺血时细胞外液中谷氨酸等兴奋性氨基酸的浓度异常升高,这些兴奋性氨基酸作用于相应受体,引起Na+、Ca2+内流以及细胞内Ca2+释放,导致Na+、Ca2+超载,进而导致神经元死亡。故将这些氨基酸称为兴奋性神经毒素。降低脑缺血时细胞外液中谷氨酸浓度,减少其与特异性受体的结合,是防治其兴奋性毒性作用,减轻缺血时神经元损伤的重要手段。胶质细胞谷氨酸转运体-1（glial glutamate transporter-1,GLT-1）是中枢神经系统含量最丰富、最活跃的谷氨酸转运体,在终止氨基酸能神经传递,维持细胞外液谷氨酸浓度处于低水平,避免谷氨酸受体的过度兴奋,从而防止其兴奋性毒性作用方面发挥重要作用。因此,有关GLT-1在脑缺血中的变化及作用的研究正成为目前的研究热点之一。我室已经取得的研究结果表明,全脑缺血预处理（global cerebral ischemic preconditioning, CIP）能够使海马CA1区GLT-1蛋白的表达明显上调,此种变化能够保护锥体神经元使其能够耐受较严重的、通常会引起迟发性神经元死亡（delayed neuronal death, DND）的缺血打击。本次实验旨在探讨在体情况下,全脑缺血预处理对海马CA1区GLT-1 mRNA表达的影响,并观察在脑缺血耐受诱导过程中,大鼠海马CA1区GLT-1 mRNA的表达变化主要发生于何种细胞:星形胶质细胞和/或锥体神经元?为进一步了解GLT-1在脑缺血时的作用和机制,通过对GLT-1的调制进行脑缺血的防治拓展思路。方法健康雄性Wistar大鼠105只,体重280-320g,随机分为5组。除control组之外,其余大鼠均首先永久凝闭椎动脉,恢复2天后,进行sham手术或脑缺血处理,具体分组如下:①control组（n=5）;②sham组:只暴露双侧颈总动脉,不阻断血流;③脑缺血预处理（CIP）组:夹闭双侧颈总动脉3 min后恢复再灌注;④损伤性缺血（ischemic insult, II）组:夹闭双侧颈总动脉8 min后恢复再灌注;⑤脑缺血预处理+损伤性缺血（CIP+II）组:夹闭双侧颈总动脉3min作为脑缺血预处理,再灌2天后,再次夹闭双侧颈总动脉8min作为损伤性缺血,然后恢复再灌注。除control组之外,其余各组又分为5个时间点,均于再灌注后6小时、1天、3天、5天、7天时断头取海马脑组织,每个时间点n=5。5μm厚的石蜡切片用于以下实验:1硫堇染色进行神经病理学评价;2原位杂交检测GLT-1 mRNA的表达;3免疫组化检测星形胶质细胞的特异抗原-胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）的表达;4 GLT-1 mRNA原位杂交与GFAP免疫组化双重染色观察双标阳性细胞的数量。参照Kato分级方法,于光学显微镜下对海马CA1区组织学改变进行分级（Histological grade, HG）,标准如下:0级,无神经元死亡;1级,散在神经元死亡;2级,成片神经元死亡;3级,几乎全部的神经元死亡。取双侧平均等级作为统计值。高倍镜下计数海马CA1区每1 mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目,每张切片双侧海马各计数3个区段,取平均数为神经元密度（Neuronal density, ND）。结果1神经病理学评价Control组大鼠海马CA1区,可见锥体神经元排列整齐、致密、共23层,细胞形态完整,胞核饱满,核仁清晰。Sham组和CIP组的各时间点,海马CA1区均无明显的DND,HG为0～Ⅰ级,7d时ND分别为202.13±12.17和196.8±15.09。II组8 min缺血打击后,从3d开始海马CA1区出现明显的DND,7d时HG为ⅡⅢ级、ND为20.93±9.63。与sham组相比,HG明显升高（P<0.01）,ND显著降低（P<0.01）。CIP+II组各时间点海马CA1区无明显DND,7d时HG为0～Ⅰ级,ND为187.67±12.35。与II组相比,HG明显降低（P<0.01）,ND显著升高（P<0.01）。表明CIP可以诱导海马CA1区神经元产生脑缺血耐受,使其能够抵抗通常会引起明显DND的严重脑缺血。2 GLT-1 mRNA的表达2.1 GLT-1 mRNA在海马CA1区锥体细胞层的表达Control组,GLT-1 mRNA原位杂交染色显示形态完整的锥体神经元,胞浆着色明显,呈蓝色,胞核不着色或着色较浅。Sham组与control组比较,在6h、1d时GLT-1 mRNA表达的平均光密度、阳性标记物总面积均明显升高（P<0.01）,以6h最为显著,3d时基本恢复至正常水平,并持续到7d。CIP组GLT-1 mRNA的表达在6h时间点最高,与sham组相比,GLT-1 mRNA表达的平均光密度在6h、1d、3d时明显升高（P<0.01）,阳性标记物总面积在1d、3d时明显升高（P<0.01）;而5d、7d时与sham组相比无显著差异。II组在8 min的损伤性缺血后早期神经元形态依然完整;至3d时,部分锥体神经元死亡,在锥体神经元区开始出现胶质细胞浸润,该细胞呈圆形或杆状,大小不均一,较神经元体积小,染为蓝色;到5d、7d时,锥体神经元几乎完全消失,同时可见大量浸润的胶质细胞。与sham组相比,GLT-1 mRNA表达的平均光密度在6h时明显降低（P<0.05）;阳性标记物总面积在1d时明显降低（P<0.01）,但随着胶质细胞的浸润,在3d、5d、7d时明显升高（P<0.01）。CIP+II组与II组相比,GLT-1 mRNA表达的平均光密度在6h、1d、3d时均明显升高（P<0.01）,阳性标记物总面积在1d、3d时明显升高（P<0.01）。在5d、7d时CIP+II组椎体神经元层的阳性标记物总面积逐渐减少,而II组随着胶质细胞的大量浸润,椎体神经元层的阳性标记物总面积则增多,因此,在7d时,CIP+II组椎体神经元层的阳性标记物总面积明显低于II组（P<0.01）。2.2 GLT-1 mRNA在海马CA1区分子层的表达Control组,可见GLT-1 mRNA阳性的胶质细胞在海马CA1区分子层散在、均匀分布。Sham组与control组相比,GLT-1 mRNA表达的平均光密度和阳性标记物总面积在6h、1d时均明显升高（P<0.01、P<0.05）,以6h时间点最显著,3d时基本恢复至正常水平。CIP组与sham组相比,GLT-1 mRNA表达的平均光密度在6h、1d、3d时明显升高（P<0.01、P<0.05）,阳性标记物总面积在6h时明显升高（P<0.01）。II组在8 min的缺血打击后6h、1d时,胶质细胞的数量无明显改变,但部分细胞的胞体肥大;从3d起,胶质细胞的数量开始增多,胞体依然肥大,细胞呈圆形或杆状,到5d、7d时最为明显。与sham组相比,GLT-1 mRNA表达的平均光密度在6h时明显降低（P<0.05）;3d以后,由于胶质细胞的大量浸润,使得阳性标记物总面积在3d、5d、7d时明显升高（P<0.01）,平均光密度在3d、5d时也明显升高（P<0.01）。CIP+II组与II组相比,GLT-1 mRNA表达的平均光密度和总面积在6h、1d时明显升高（P<0.01）,但阳性标记物总面积在3d、5d、7d时则低于II组（P<0.01）。3 GFAP的表达Control组海马CA1区,可见星形胶质细胞散在均匀分布,星形胶质细胞的突起不环绕锥体神经元。Sham组与control组相比,GFAP阳性标记物总面积在各时间点均明显减少（P<0.05、P<0.01）,平均光密度在各时间点均无明显变化,星形胶质细胞的突起亦不环绕锥体神经元。CIP组与sham组相比,CA1区星形胶质细胞的突起有所延长,可见在一定程度上环绕锥体神经元,阳性标记物平均光密度及总面积在各时间点均明显上调（P<0.05、P<0.01）,以13d较为明显。II组海马CA1区自损伤性缺血后GFAP阳性细胞数目逐渐增多,胞体渐趋肥大,突起在早期有所延长,但并不包绕锥体神经元,5d时突起明显增粗变短。与sham组相比,各时间点平均光密度和阳性标记物总面积均显著升高（P<0.01）。CIP+II组,海马CA1区GFAP阳性细胞胞体并不明显增大,但突起明显延长并环绕锥体神经元,形成非常明显的网格状,末次缺血后3d达高峰,一直持续至7d。与II组相比,平均光密度在5d、7d时显著下调（P<0.05、P<0.01）,但各时间点阳性标记物总面积无明显差异。4 GLT-1 mRNA与GFAP双标染色Sham组与control组相比,GLT-1 mRNA原位杂交和GFAP免疫组化双阳性标记的细胞数量,在各时间点均未见显著变化。CIP组与sham组相比,各时间点GLT-1 mRNA原位杂交和GFAP免疫组化双阳性标记的细胞数量亦无显著变化。II组与sham组相比,早期双阳性细胞数量无显著变化;3d时,星形胶质细胞明显增多,胞体肥大,突起有所延长,5d时明显增粗变短,与sham组相比,双阳性细胞数在3d、5d、7d时明显升高（P<0.01）。另外,II组自第3天开始有多量蓝色小细胞侵润,该类细胞较星形胶质细胞胞体略小,呈圆形或杆状,仅着为蓝色,但无星形胶质特异性蛋白GFAP样红色突起,此类细胞在5d、7d时进一步增多,推测可能为小胶质细胞。CIP+II组双阳性细胞数量与sham组相比在各时间点无明显变化;与II组相比,则在3d、5d、7d明显降低（P<0.05、P<0.01）。结论1严重的损伤性缺血可以导致大鼠海马CA1区大量锥体神经元发生明显DND,而提前2天的3 min缺血预处理可以保护锥体神经元,使其能够耐受通常会引起明显DND的8 min损伤性缺血。2缺血预处理可使大鼠海马CA1区锥体神经元GLT-1 mRNA表达增多。该变化可能保护锥体神经元使其能够耐受随后的损伤性缺血打击,参与缺血预处理的脑保护作用。3缺血预处理可使大鼠海马CA1区星形胶质细胞GLT-1 mRNA表达增多,该变化可能参与缺血预处理的脑保护作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 研究论文 脑缺血耐受诱导过程中大鼠海马CA1 区谷氨酸转运体GLT-1 mRNA 的表达
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 附图
• 附表
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述 谷氨酸转运体GLT-1 的剪接变异体研究进展
• 致谢
• 个人简历