论文摘要
目的和研究背景：前列腺癌是男性泌尿生殖系统常见肿瘤之一,在美国占男性肿瘤死亡率第二位,近年来在我国的发病率和死亡率也是逐年升高。前列腺癌是对雄激素依赖的肿瘤,所以大多数前列腺癌患者刚开始对于祛除雄激素治疗有效,但约50%-60%患者在接受内分泌治疗后的18—24个月后会转变成为激素难治性前列腺癌（Hormone refractory prostate cancer, HRPC）。而HRPC患者骨转移的发生率高达65—75%,骨是最易产生远处转移的组织。唑来膦酸（zoledronic acid, ZOL）是目前唯一被证实能减少前列腺癌骨转移以及骨相关事件发生率,并能持久缓解疼痛的双磷酸盐药物。通过研究发现,唑来膦酸不但能通过抑制破骨细胞的活动和增殖,对抗肿瘤细胞的骨转移,还有直接抑制肿瘤细胞生长的作用（乳腺癌、骨肉瘤等肿瘤细胞）。目前,晚期前列腺癌患者的治疗一直是困扰临床泌尿外科的一个难题,而唑来膦酸对肿瘤细胞的增殖抑制作用的特性,无疑为临床治疗HRPC患者提供了新的思路,它与目前公认的HRPC一线化疗药物多西他赛（docetaxel, DOC）联合应用能否产生协同作用更加成为了人们关注的课题。目前国内外相关领域的研究尚处于基础研究阶段。国外部分研究已证实,唑来膦酸主要通过甲羟戊酸途径起到抗肿瘤的作用。而对唑来膦酸和多西他赛联合用药的基础研究则更少。两者联合运用于乳腺癌细胞的研究提示其具有协同抗肿瘤作用,而对于前列腺癌的作用在最新的肿瘤学杂志上也开始出现零星的报道（Acta Onlocogia）,但资料还是非常有限。本研究的目的正是为进一步验证唑来膦酸对激素非依赖性前列腺癌PC-3细胞系的抗肿瘤作用,同时探讨唑来膦酸与多西他赛联合应用于PC-3细胞是否具有协同作用,并通过对被抑制肿瘤细胞的细胞周期分布的影响,来揭示其抗肿瘤作用的可能机制,为临床治疗提供理论依据。方法和结果：1.MTT比色法观察ZOL对前列腺癌PC-3细胞的增殖抑制作用本部分研究用不同浓度的ZOL （6.25μg/ml-400μg/ml）作用于体外培养的PC-3细胞,药物作用2小时后,换正常细胞培养液继续培养,在72小时后采用噻唑兰（MTT）比色法检测细胞增殖活性。结果表明,ZOL可以显著抑制PC-3细胞的增殖,这种作用随着药物浓度的增加而增强。在100μg／ml的浓度下,PC-3细胞抑制率达到19.0%,在200μg／ml浓度下抑制率达到44.5%,而400μg／ml浓度时则达到了57.9%。光镜下观察到细胞浓度明显降低。2. MTT比色法观察ZOL与DOC联合应用对前列腺癌PC-3细胞的增殖抑制作用本部分研究采用不同浓度的ZOL（药物作用2小时）与10ng/ml、100ng/ml浓度下DOC（药物作用24小时）联合作用于体外培养的PC-3细胞,换正常培养液继续培养48小时后采用噻唑兰（MTT）比色法检测细胞增殖活性。结果表明,ZOL与DOC具有联合抑制细胞增殖的作用,在DOC浓度条件不变情况下,这种增殖抑制作用随着ZOL药物浓度的增加而增强。在10ng／ml浓度DOC条件时,200μg／ml浓度ZOL可抑制49.3%的PC-3细胞,400μg／ml时抑制率达到61.4%；在100ng／ml浓度的DOC条件时,200μg／ml浓度ZOL的细胞抑制率达到59.7%,400μg／ml时抑制率达到74.2%。光镜下细胞密度明显降低,且伴有细胞质减少的表现。3.流式细胞仪检测PC-3细胞周期的分布变化本部分研究将PC-3细胞接种于6孔板内培养,过夜贴壁后,用不同浓度的ZOL作用2h,换正常培养液继续培养72h。胰酶消化处理后收集离心,放入70%冰乙醇后制成单细胞悬液,采用流式细胞仪分析细胞周期分布及细胞凋亡率。结果发现前列腺癌PC-3细胞的自然凋亡率为0.73%,G1、S、G2期的细胞比例分别是61.2%、36.61%、2.13%。经过400μg／ml ZOL处理后的细胞凋亡率是5.93%,G1、S、G2期的细胞比例分别是45.71%、48.45%、5.83%。经过ZOL处理后细胞凋亡增加,而G1期细胞明显减少,S期细胞明显增加,G2期细胞有所增加。结论：本实验通过对ZOL、DOC作用前列腺癌PC-3细胞后的细胞增殖活性观察以及细胞周期的分布变化情况,验证了ZOL对非雄激素依赖性前列腺癌PC-3细胞具有明显的增殖抑制作用,诱导细胞凋亡,并能使PC-3细胞出现细胞周期停滞在S期以及G2期。且这种作用与ZOL的浓度呈正相关的关系。研究同时发现唑来膦酸与多西他赛联合作用于PC-3细胞较唑来膦酸或者多西他赛单独使用具有更强的增殖抑制作用,两者在抑制PC-3肿瘤细胞增殖上具有联合作用。