淡水涡虫细胞分散方法研究及干细胞表达基因pumilio的克隆与分析

论文摘要

制备成体涡虫细胞悬液是进行涡虫成体干细胞（neoblasts）分离及体外生物学特性研究的基础。本文以日本三角涡虫（Dugesia japonica）和阳城多目涡虫（Polycelisyangchengensis）为材料，采用胰酶消化法对涡虫细胞悬液的制备方法进行研究，对影响分散效果的消化温度、胰酶浓度、离心速度进行了比较。结果表明：用0.25%的胰酶（pH=7.4），20℃消化成体涡虫组织15min，然后以4℃、1000rpm离心3min，收集沉淀，重悬后显微镜检查显示在该条件下得到的悬液中细胞形态完整，组织碎片少，是制备涡虫细胞悬液的首选方法。对neoblasts标记是利用流式细胞技术分选及体内定位neoblasts的基础。本文运用RACE方法成功克隆出P. yangchengensis的neoblasts特异性表达基因pumilio。序列分析表明：P. yangchengensis pumilio基因全长约2048bp，根据Kozak规则确定其开放阅读框（open reading frame, ORF）长度为1803bp，编码约600个氨基酸，分子量约为66.2kD，等电点约为7.4，5`非编码区（5`UTR）长约92bp，3`非编码区（3`UTR）长约153bp。PUM同源域（Pumilio homology domain, PUM-HD），位于羧基端，由368个氨基组成（212579位），包含两个侧翼区和8个重复区域。与pumilio基因家族成员比较，P. yangchengensis与Dugesia japonica的pumilio基因核酸及编码氨基酸序列的同源率较高，分别为66.8%和76.2%；二者PUM-HD核酸及编码氨基酸序列的同源率分别为70.9%和84.9%。遗传演化分析表明：P. yangchengensis与同属一门的D. japonica、Clonorchis sinensis和Schistosoma mansoni构成一个进化上的单系，表明它们有较近的亲缘关系。总之，该研究建立的涡虫体细胞的分散方法及克隆的neoblasts特异性表达基因pumilio为下一步涡虫neoblasts筛选及生物学研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词
• 1 引言
• 1.1 淡水涡虫综述
• 1.1.1 淡水涡虫生活习性
• 1.1.2 淡水涡虫的形态结构
• 1.1.3 淡水涡虫的繁殖方式
• 1.1.4 淡水涡虫的采集
• 1.2 淡水涡虫再生及干细胞
• 1.2.1 淡水涡虫再生过程
• 1.2.2 淡水涡虫再生研究进展
• 1.2.3 涡虫干细胞研究
• 1.2.4 涡虫干细胞相关基因研究
• 1.3 Pumilio 基因研究进展
• 1.3.1 PUF 的发现
• 1.3.2 PUF 结构特征
• 1.3.3 PUF 的生物学功能
• 1.3.4 PUF 作用机制
• 1.3.5 DjPUM
• 1.4 立题依据与意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 实验器材及设备
• 2.1.4 实验主要试剂的配制
• 2.1.5 所用引物序列
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 细胞最佳分散条件的筛选
• 2.2.2 最佳离心速度的选择
• 2.2.3 总 RNA 的提取
• 2.2.4 逆转录制备 cDNA
• 2.2.5 阳城多目涡虫 pumilio 基因的克隆
• 2.2.6 PCR 产物的克隆与检测
• 2.2.7 RACE 技术扩增阳城多目涡虫 pumilio 基因全长
• 3 结果与分析
• 3.1 日本三角涡虫细胞分散
• 3.1.1 不同胰酶浓度和消化温度对成体涡虫细胞分散效果的影响
• 3.1.2 不同速度离心结果
• 3.2 阳城多目涡虫总 RNA 的提取与 cDNA 的转录
• 3.3 阳城多目涡虫 pumilio 基因保守区的获得
• 3.4 Pumilio 基因 3`端和 5`端扩增
• 3.5 Pumilio 基因生物信息学分析
• 3.5.1 Pumilio 基因开放阅读框（ORF）的分析
• 3.5.2 遗传进化分析
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果