论文题目: 错位双链寡核苷酸的制备及生物学评价
论文类型: 博士论文
论文专业: 发酵工程
作者: 聂实践
导师: 杜连祥
关键词: 错位双链核糖核酸,过滤培养技术,多核苷酸磷酸化酶,急性毒性,抗肿瘤药效,抗病毒药效
文献来源: 天津科技大学
发表年度: 2005
论文摘要: 本研究利用中空纤维膜技术,在5升标准搅拌型自动控制发酵罐中进行大肠杆菌AS.1.183的过滤培养,大肠杆菌细胞的最高浓度可达250g/L（湿重,含水70%）,细胞内多核苷酸磷化酶（PNPase）的活性可以稳定在80u/g（湿重）左右,发酵罐的体积生产效率比分批发酵提高近10倍。 在PNPase提取纯化的过程,研究了研磨破碎、超声波破碎、高压破碎大肠杆菌细胞的方法,发现超声波破碎方法明显优于其它方法,细胞破碎条件同PNPase活性有关。研究探索了使用中空纤维膜替代透析袋除盐的方法,此法在PNPase纯化过程中,不仅大大缩短了除盐时间,而且减少了缓冲液的用量。使PNPase的生产成本降低了很多。 利用大肠杆菌PNPase和5′-二磷酸核苷酸底物,通过控制底物的浓度及其反应条件,合成出错位双链核糖核酸(poly I∶C12U)试验样品,样品中的胞苷酸（C）和尿苷酸（U）的比值接近12∶1。 为证明合成的poly I∶C12U中C和U的分布情况,将单链的poly C12U反转录为对应的单链DNA,经PCR扩增获得特殊序列的双链DNA片段,再将该DNA片段克隆到T载体中,测序分析后证明C在poly C链中是不连续的,U在poly C12U合成时可均匀插入到poly C中。使用碱和碱性磷酸酶降解poly I∶C12U,使其生成三种核苷,经反相-高效液相色谱（RP-HPLC）测定也证明poly I∶C12U中的碱基I∶C∶U组成比例接近13∶12∶1。该方法可分析核苷的组成,可用于监控产品的制备过程。 使用小鼠、大鼠、犬静脉和腹腔的给药方法,研究了poly I∶C12U的急性毒性,结果表明poly I∶C12U的毒性很低,急性毒性反应是一过性可逆性反应,没有对机体造成明显损害。通过高、中、低不同剂量的polyI∶C和polyI∶C12U药物的热原试验比较,polyI∶C12U药物的毒副作用明显低于polyI∶C,对
论文目录:
论文摘要
ABSTRACT
目录
第一章 绪论
1.1 引言
1.2 双链核糖核酸(dsRNA)的早期研究
1.3 双链核糖核酸(dsRNA)的研究进展
1.3.1 结构修饰研究
1.3.2 作用机理研究
1.3.3 人体临床试验研究
1.4 国内研究背景
1.5 本文研究内容
第二章 高多核苷酸磷酸化酶的大肠杆菌过滤培养
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.2.1 菌种
2.2.2 过滤培养系统
2.2.3 菌体收集
2.2.4 摇床
2.2.5 培养基
2.2.6 分批发酵
2.2.7 过滤发酵
2.2.8 测定方法
2.3 结果与讨论
2.3.1 分批培养
2.3.2 过滤培养
2.3.3 两种培养过程碳源、氮源的变化
2.3.4 稀释速率的影响
2.3.5 过滤培养和分批培养生产PNPase能力的比较
2.4 本章小结
第三章 多核苷酸磷酸化酶的提取与纯化
3.1 引言
3.2 材料和方法
3.2.1 菌体制备
3.2.2 菌体破碎
3.2.3 硫酸链霉素沉淀
3.2.4 (NH_4)_2SO_4分级沉淀
3.2.5 酶液透析
3.2.6 柱分离
3.2.7 试剂与材料
3.2.8 设备及仪器
3.2.9 关键操作步骤
3.2.10 酶活性测定方法
3.3 结果与讨论
3.3.1 菌体破碎
3.3.2 透析
3.3.3 DEAE纤维素柱层析
3.4 本章小结
第四章 poly I：C_(12)U的合成及测定
4.1 引言
4.2 错位双链寡核苷酸(poly I：C_(12)U)的合成
4.2.1 材料与方法
4.2.1.1 合成底物
4.2.1.2 底物含量及纯度的测定
4.2.1.3 多核苷酸磷酸化酶(PNPase)
4.2.1.4 poly I的合成
4.2.1.5 poly C_(12)U的合成
4.2.1.6 poly I：C_(12)U的制备
4.2.1.7 仪器
4.2.2 结果与讨论
4.3 错位双链寡核苷酸中碱基比例的测定研究
4.3.1 材料与方法
4.3.1.1 材料
4.3.1.2 方法
4.3.2 结果与讨论
4.4 错位双链核糖核酸的碱基序列测定
4.4.1 材料与方法
4.4.2 结果与讨论
4.5 本章小结
第五章 polyI：C_(12)U急性毒性试验研究
5.1 引言
5.2 小鼠静脉给药的急性毒性试验
5.2.1 试验目的
5.2.2 材料与方法
5.2.3 结果
5.3 小鼠静脉注射最大耐受量的测定
5.3.1 试验目的
5.3.2 材料与方法
5.3.3 结果
5.4 大鼠静脉给药急性毒性的测定
5.4.1 试验目的
5.4.2 材料与方法
5.4.3 结果
5.5 大鼠静脉注射最大耐受量的测定
5.5.1 试验目的
5.5.2 材料与方法
5.5.3 结果
5.6 犬静脉给药的急性毒性试验
5.6.1 试验目的
5.6.2 材料与方法
5.6.3 结果与讨论
5.7 腹腔注射给药对小鼠和大鼠急性毒性反应观察和最大耐受量的测定
5.7.1 试验目的
5.7.2 材料与方法
5.7.3 结果
5.8 poly I：C_(12)U热原反应试验
5.8.1 试验目的
5.8.2 材料与方法
5.8.3 结果与讨论
5.8 本章小结
第六章 错位双链寡核苷酸生物学活性的研究
6.1 引言
6.2 错位双链寡核苷酸体外抗肿瘤活性试验
6.2.1 试验目的
6.2.2 材料与方法
6.2.3 结果与讨论
6.3 错位双链寡核苷酸体内抗肿瘤药效试验
6.3.1 试验目的
6.3.2 材料与方法
6.3.3 结果与讨论
6.4 错位双链寡核苷酸对裸鼠移植的人肝癌细胞Bel-7402和非小细胞肺癌细胞PAA的药效观察
6.4.1 试验目的
6.4.2 材料与方法
6.4.3 结果与讨论
6.5 错位双链核糖核酸抑制柯萨奇CVB3病毒感染细胞的研究
6.5.1 试验目的
6.5.2 材料与方法
6.5.3 结果与讨论
6.6 本章小结
第七章 结论与展望
7.1 结论
7.2 创新点
7.3 展望
致谢
攻读博士学位期间发表论文
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发布时间: 2007-01-10
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