人肝癌干细胞单抗抑制肝癌的生长和转移

论文摘要

肝癌是世界5大高发癌症之一,在中国,肝癌是死亡率前三的恶性肿瘤,而转移和复发是肝癌预后差的主要原因,晚期肝癌放化疗后复发率达到60%。研究认为肿瘤干细胞同肿瘤转移和复发密切相关,因此靶向肝癌干细胞治疗可能为肝癌的治疗提供新的思路。采用酶消化法分离肝癌组织中癌细胞进行原代培养,同时将肝癌组织在SCID鼠体内进行移植瘤传代,以流式细胞术检测其中肝癌干细胞相关标志物。通过PKH26染色实验,无血清悬浮培养,流式细胞术和细胞免疫荧光确定肝癌干细胞研究的细胞系模型。在以免疫荧光流式细胞术和抑制细胞增殖实验筛选抗肝癌干细胞的功能性单抗之后,采用流式细胞术和细胞免疫荧光法检测单抗的表达情况；采用抑制细胞增殖实验,Transwell实验进行单抗体外功能的研究；采用裸鼠移植瘤治疗实验进行单抗体内功能的研究。以Western blot鉴定单抗识别抗原蛋白分子量,通过免疫亲和层析和MALDI-TOP-PMF质谱技术鉴定肝癌干细胞相关的功能基因。免疫共沉淀和细胞免疫荧光共定位对质谱鉴定结果进行回证分析。成功从肝癌组织中分离癌细胞进行原代培养。流式细胞术检测结果显示不同肝癌组织中肝癌干细胞标志物ESA、CD133、CD24、CD44、AFP的表达差异显著。人肝癌细胞株MHCC97H在无血清培养条件下可成球生长,PKH26染色结果显示MHCC97H球体多由单个肝癌干细胞增殖分化形成,球体细胞较亲本细胞顺铂耐药性增强（IC50：69.7ug／ml vs22.1ug／ml）,CD90+细胞比例显著上调（23.8%vs2.7%）,且观察到细胞球中CD90与PKH26共表达,证明CD90+MHCC97H细胞可能是肝癌干细胞。杂交瘤单抗3G7、4F11、11C9、15B7、15D2均能较特异地识别MHCC97H中CD90+肿瘤干细胞,其中11C9和4F11在CD90+肝癌干细胞识别比例分别是42.3%和21.6%。单抗11C9显著球体细胞增殖抑制（抑制率23.2%）,而对MHCC97H细胞无明显增殖抑制作用。MHCC97H成球细胞中单抗11C9阳性细胞的比例较亲本细胞显著上调（11.9%vs3.8%）,细胞球免疫荧光染色发现11C9与PKH26共染色,并且11C9与CD90共表达,证明单抗11C9识别CD90+肝癌干细胞。11C9+细胞同亲本细胞和11C9-细胞相比,耐药性更强（5-FU,IC50：289.37ug／ml vs101.25ug／ml vs71.26ug／ml）；成球能力更强（成球数：（6±3）vs（5±3）vs（3±3））；侵袭能力更强（侵袭细胞数：（111±14）vs（87±14）vs（57±4））；迁移能力更强（迁移细胞数：（156±15）vs（130±16）vs（114±11））。在体内,单抗11C9联合5-FU治疗可以非常显著地能显著地抑制肝癌移植瘤的复发。MALDI-TOP-PMF质谱技术鉴定单抗11C9识别靶抗原是A（见注释）,免疫共沉淀和细胞免疫荧光共定位回证的结果也证实单抗11C9识别的靶抗原确为A。同样,单抗4F11的阳性细胞比例在MHCC97H成球细胞中较亲本细胞显著上调（12.5%vs2.7%）,单抗4F11可在细胞球中与PKH26共染色,并与CD90共表达,证明单抗4F11识别CD90+肝癌干细胞。单抗4F11对成球细胞增殖的抑制率远大于对亲本MHCC97H细胞增殖的抑制率（29.4%vs12.0%）,并且并且强烈抑制MHCC97H细胞的自我更新（成球抑制率达到58.0%）。4F11还可显著抑制MHCC97H细胞的体外侵袭和迁移,抑制率分别为48.6%和47.6%。MALDI-TOP-PMF质谱技术鉴定单抗4F11识别靶抗原可能是B,C和D（见注释）。肝癌组织存在肿瘤干细胞；细胞株MHCC97H中肿瘤干细胞标志物的主要是CD90,单抗11C9和4F11均能较特异地识别CD90+肝癌干细胞。单抗11C9能显著抑制富肝癌干细胞的细胞的增殖,11C9+细胞具有肿瘤干细胞的多种特征,单抗11C9联合化疗能显著抑制人肝癌移植瘤的复发,提示单抗11C9是一个有潜力的靶向肝癌干细胞的靶向治疗剂,部分肝癌的耐药性可能同11C9+肝癌干细胞相关,靶向11C9靶抗原A的抗肝癌干细胞治疗联合化疗将可能有效抑制肝癌复发；单抗4F11能显著抑制富肝癌干细胞的细胞的增殖,抑制癌细胞的迁移和侵袭,可作为肝癌干细胞靶向治疗候选的抗体药物。本研究为肝癌干细胞靶向治疗提供候选抗体先导药物和新的治疗靶标,同时也为肝癌复发的治疗提供新的思路和策略。

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图表索引

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Abstract

前言

一、材料和方法

（一）实验材料

1.细胞

2.组织标本

3.动物

4.试剂

4.1 抗体

4.2 主试剂

5.主要仪器及用品

6.计算机分析软件

7.主要自配试剂及配方

（二）实验方法

1.细胞培养

1.1 人肝癌组织来源细胞原代培养

1.2 人肝癌细胞株及杂交瘤细胞的培养

1.3 肝癌干细胞的无血清悬浮培养

2.细胞免疫荧光实验

2.1 活细胞免疫荧光实验

2.2 固定细胞免疫荧光实验

2.3 球体细胞固定免疫荧光实验

3.流式细胞术检测标志物比例

4.免疫组织化学实验

5.细胞体外实验

5.1 PKH26染色实验

5.2 sphere细胞成球抑制实验

5.3 细胞增殖实验

5.4 Transwell侵袭实验

5.5 Transwell迁移实验

6.动物实验

6.1 SCID鼠致瘤实验

6.2 抗体动物治疗实验

7.抗体纯化

7.1 无血清杂交瘤上清的收集

7.2 ELISA酶联免疫吸附法测定抗体产量

7.3 疏水层析纯化IgM抗体

7.4 ProteinG亲和纯化IgG抗体

8.抗原亲和纯化鉴定

8.1 细胞蛋白提取

8.1.1 细胞总蛋白的提取

8.1.2 细胞水溶性蛋白和膜溶性蛋白的提取

8.2 蛋白定量

8.3 抗体亲和柱的制备

8.4 亲和纯化

8.5 质谱鉴定

8.6 免疫共沉淀纯化抗原

8.7 免疫印迹Western blotting

9.统计学分析

二、实验结果

（一）人肝癌干细胞的分离和鉴定

1.人肝癌组织中肝癌干细胞的分离鉴定

1.1 人肝癌组织中癌细胞的分离及原代培养

1.2 人肝癌组织原代细胞中肿瘤干细胞标志物检测

1.3 人肝癌移植瘤中肿瘤干细胞标志物检测

2.人肝癌干细胞研究的细胞模型的筛选建立

2.1 人肝癌细胞株MHCC97H的无血清悬浮培养

2.2 人肝癌细胞株MHCC97H球体细胞具有顺铂耐药性

2.3 人肝癌细胞株MHCC97H亲本细胞及球体细胞中肝癌干细胞标志物表达情况

（二）抗人肝癌干细胞功能性单抗的筛选鉴定

1.流式细胞术筛选靶向肝癌干细胞的单克隆抗体

2.体外功能实验筛选靶向肝癌干细胞功能性单抗

（三）抗人肝癌干细胞单抗11C9功能研究和靶抗原分离鉴定

1.抗人肝癌干细胞功能性单抗11C9在人肝癌细胞株中的表达情况

1.1 单抗11C9在人肝癌细胞株MHCC97H中表达情况

1.2 人肝癌细胞株MHCC97H中11C9识别抗原的亚细胞结果定位

2.单抗11C9阳性细胞的肿瘤干细胞相关分子表型的鉴定

3.单抗11C9阳性细胞的肿瘤干细胞特性鉴定

3.1 11C9靶抗原表达阳性细胞和阴性细胞耐药性比较

3.2 11C9靶抗原表达阳性细胞和阴性细胞自我更新能力比较

3.3 11C9靶抗原表达阳性细胞和阴性细胞侵袭能力比较

3.4 11C9靶抗原表达阳性细胞和阴性细胞迁移能力比较

4.抗人肝癌干细胞单抗11C9阻断抗原功能基因的体外功能研究

4.1 11C9单抗对人肝癌干细胞增殖的抑制作用

4.2 11C9单抗对人肝癌细胞株MHCC97H细胞侵袭和迁移的抑制作用

5.抗人肝癌干细胞单抗11C9阻断抗原功能基因的体内功能研究

6.抗人肝癌干细胞单抗11C9识别靶抗原的分离鉴定

6.1 功能性单抗11C9的纯化

6.2 优化和筛选提取单抗识别抗原的方法与功能性抗原的分子量鉴定

6.3 亲和层析纯化11C9识别抗原蛋白

6.4 单抗11C9识别抗原蛋白的质谱鉴定

6.5 单抗11C9识别抗原基因的鉴定

6.5.1 免疫共沉淀验证11C9抗原基因

6.5.2 细胞免疫荧光共定位验证11C9抗原基因

（四）抗人肝癌干细胞单抗4F11功能研究和靶抗原分离鉴定

1.抗人肝癌干细胞功能性单抗4F11在人肝癌细胞株中的表达情况

1.1 单抗4F11在人肝癌细胞株MHCC97H中表达情况

1.2 人肝癌细胞株MHCC97H中4F11识别抗原的亚细胞结果定位

2.单抗4F11阳性细胞的肿瘤干细胞相关分子表型的鉴定

3.抗人肝癌干细胞单抗4F11阻断抗原功能基因的体外功能研究

3.1 单抗4F11对人肝癌干细胞增殖的抑制作用

3.2 单抗4F11对人肝癌细胞株MHCC97H细胞侵袭的抑制作用

3.3 单抗4F11对人肝癌细胞株MHCC97H细胞迁移的抑制作用

4.抗人肝癌干细胞单抗4F11识别靶抗原的分离鉴定

4.1 功能性单抗4F11的纯化

4.2 优化和筛选提取单抗识别抗原的方法与功能性抗原的分子量鉴定

4.3 亲和层析纯化4F11识别抗原蛋白

4.4 单抗4F11识别抗原蛋白的质谱鉴定

三、讨论

小结

论文综述

参考文献

致谢

附录

个人简历

基金资助情况

人肝癌干细胞单抗抑制肝癌的生长和转移

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