腹泻相关病毒多重检测技术的研究

论文摘要

目的：腹泻病是引起全世界儿童发病和死亡的主要原因之一,病毒性腹泻在感染性腹泻中占有重要的比例,A组轮状病毒、杯状病毒、肠道腺病毒和星状病毒是最主要的病原,且常见混合感染。因此,针对病毒性腹泻发生率高、传播快,易暴发等特点,迫切需要建立一套同时具有高通量、快速、敏感、特异、经济并且操作简单的检测技术,用于腹泻暴发流行时的快速诊断。本研究拟建立两种高通量快速检测技术,可以同时检测7种腹泻相关病毒,并对其进行评价,以完善和推动病毒性腹泻的实验室诊断技术。方法：（一）利用GeXP System建立7种腹泻相关病毒的多重检测方法1.从NCBI网站的GenBank数据库中下载所有A组轮状病毒、诺如病毒GⅠ、GⅡ型、札如病毒、肠道腺病毒、入星状病毒、人博卡病毒Ⅱ型的核苷酸序列,利用GeXP eXpress Profiler分别设计针对上述各基因的特异性引物。2.建立7重RT-PCR方法同时扩增上述7种腹泻相关病毒,用GenomeLabTM GeXP Analysis system进行检测,对其进行方法学评价（包括灵敏度、特异性等）。（二）建立7种腹泻相关病毒的Luminex xMAP液相芯片检测方法1.从NCBI网站的GenBank数据库中下载所有A组轮状病毒、诺如病毒GⅠ、GⅡ型、札如病毒、肠道腺病毒、人星状病毒、人博卡病毒Ⅱ型的核苷酸序列,利用Primer Premier5和PrimerPlex2分别设计针对上述各靶目的片段的特异性引物和探针。2.建立7种病毒的Tem PCR多重扩增方法。3.建立Luminex xMAP液相芯片检测方法,对其进行方法学（包括特异性、灵敏度、重复性等）评价,并初步应用于140份临床标本的检测,同时与常规RT-PCR方法的检测结果进行比较,对其临床应用进行评价。结果：1.利用GeXP system建立的多重检测方法可以同时特异地检测出7种腹泻相关病毒,灵敏度至少在104拷贝水平,通过对EV71、人双埃克病毒和小双节RNA病毒阳性标本的验证,均未见交叉反应,表明该方法特异性较好。2.将Tem PCR与Luminex xMAP相结合,建立了能同时快速检测7种腹泻相关病毒的液相芯片检测技术,人博卡病毒2型和肠道腺病毒的检出限为103拷贝,A组轮状病毒、诺如病毒GⅠ、GⅡ型、札如病毒和人星状病毒的检出限为104拷贝,与EV71、人双埃柯病毒、小双节RNA病毒之间无交叉反应,且相互之间亦无明显交叉反应,具有较好的特异性；批内、批间试验变异系数都小于5%,具有很好的重复性。对140份临床样本的检测结果与常规RT-PCR相比,本方法的检测灵敏度可达75%以上,特异度达97%以上,经统计学分析,Kappa值均大于0.75,可认为所建立的液相芯片检测技术的结果是可信的。结论：本研究开展了两种腹泻相关病毒的多重快速检测技术的研究（包括特异性、灵敏度、重复性等）及其临床应用的评价,成功建立了一个反应中能同时检测7种腹泻相关病毒的两种多重快速检测技术。本研究完善了腹泻相关病毒的实验室检测技术,也为腹泻暴发疫情的应对提供了潜在的技术储备。

论文目录

• 主要英文缩略语
• 摘要
• Abstract
• 前言
• 第一部分 建立检测7种腹泻相关病毒的GeXP毛细管电泳技术
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 建立检测7种腹泻相关病毒的Luminex液相芯片技术
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 总结
• 综述
• 参考文献
• 致谢