论文摘要
本研究目的是构建细菌荧光素酶基因（lux）标记的汞特异生物传感器并对其在汞污染土壤中检测应用的可行性进行探讨。本研究内容主要包括:两株lux标记工程菌的构建以及发光性能的比较分析、改造Pseudomonas putida X4菌株的内生质粒构建汞响应的发光标记菌株以及组成型发光的对照菌株、X4发光标记菌株在汞污染土壤检测中的应用等三个方面。结果如下:1.分别以P.putida X4,Enterobacter aerogenes NTG-01为宿主菌,构建含有merR-luxCDABE标记的重组质粒,并通过氯化钙法将质粒导入到已消除质粒的X4和NTG-01宿主菌株中,构建两株汞特异生物传感器,并对其发光性能进行比较研究。结果表明:NTG-01发光标记菌株的最佳诱导时期是对数生长末期,而X4发光标记菌株的最佳诱导时期是对数生长中期;两发光标记菌株的最短诱导时间是30 min,随着诱导时间的延长发光强度增大,X4标记菌株在诱导4 h时达到最大光强,而NTG-01在5h达到最大光强;在28℃、pH 7、起始细胞数量为106 CFU/mL时,两传感器对汞的最低检测限为100 pmol/L;其他重金属离子(Cd2+,Zn2+,Co（2+）,Cu2+,Pb2+)在nanomolar水平不会干扰实验的测定。2.以luxABCDE为报告基因,改造X4菌株的内生质粒pX4,形成lux标记的重组质粒pUC-luxABCDE-merR-Kan-X4以及pUC-luxABCDE-Kan-X4,并通过电转化将重组质粒导入到已经消除质粒的宿主菌X4中,构建lux标记的特异性汞响应发光菌株以及组成型发光的对照菌株。通过比较对照菌株在不同汞浓度下发光强度的变化,研究了汞对微生物细胞的毒害以及诱导作用。结果表明:低于1μmol/L汞对微生物细胞基本没有毒害作用,主要是诱导作用;1～10μmol/L汞对细胞既有毒害作用又有诱导作用,发光值急剧下降;高于20μmol/L汞对细胞主要是毒害作用;100μmol/L时,发光值降到零,很显然是由于汞的毒性效应所致。3.以X4（pUC-luxABCDE-merR-Kan-X4）为研究对象,对该工程菌在农阳土壤的定殖存活能力以及对汞污染土壤检测的可行性进行探讨。结果表明:该工程菌株在灭菌土壤和天然土壤中的存活趋势基本相同,在30 d后仍可保持在104CFU/g土壤;四个不同汞污染程度的土壤,利用生物传感器检测的土壤水抽提液汞的浓度均稍低于化学检测方法。研究结果显示:生物传感器方法与化学方法有效结合可以对污染土壤生物可利用性汞进行半定量检测。