论文摘要
[目的]揭示新生儿TLR-4基因启动子区SNP位点存在的生物学意义,为进一步从基因多态性角度分析SNP位点碱基变异对靶基因表达的影响,探讨TLR4启动子区SNP与新生儿G-菌感染的相关性提供依据。[方法]本研究用PCR法特异性扩增含所需位点的人TLR-4基因启动子区DNA片段,构建PGL3-TLR-4启动子基础质粒,定点突变获得含目的SNP位点启动子质粒,用HEK293细胞转染各质粒并检验其转染效率,以双荧光素酶报告基因系统观察TLR4基因启动子区SNP对转录活性的影响。[结果]1.pGL3-TLR4启动子基础质粒的构建和鉴定：利用PCR法从目的基因组中扩增出含6个SNP位点的TLR4基因启动子片段计2697bp（-2694-+3）,将PCR产物连接重组到PMDT-18载体上,菌落PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,产物位于2000bp-5000bp之间,约3000bp,与实验预期片段大小一致。将产物双酶切后构建至荧光报告系统载体pGL3中。电泳初步鉴定质粒构建成功。测序鉴定显示,pGL3-TLR4构建质粒插入片段序列中,碱基与数据库中序列完全一致。2.-2604GG、-2570GG、-2431CC、-2081AA、-2026GG、-1607CC突变质粒构建与鉴定：以构建的pGL3-TLR4启动子基础质粒为模板,分别用-2604A、-2570A、-2431T、-2081G、-2026A、-1607T位点突变引物及定点突变试剂盒进行定点突变反应,定点突变获得突变质粒。测序结果证实成功得到-2604GG、-2570GG、-2431CC、-2081AA、-2026GG、-1607CC突变质粒。3.双荧光素酶报告基因系统检测：选用HEK293细胞作为转染细胞,质粒转染同时转染带GFP荧光标记的真核表达载体（pCY/U6/GFP/Neo）,以观察HEK293的转染效率。转染48H,观察到大量绿色荧光蛋白表达。双荧光素酶报告系统显示：与pGL3-TLR4基础启动子质粒相比,-2431位点由T突变为C,-2026位点由A突变为G后,启动子活性下降,而-1607位点由T突变为C,-2081位点由G突变为A,-2570位点由A突变为G,-2604位点由A突变为G, TLR4启动子活性没有明显改变。[结论]-2431位点由T突变为C,-2026位点由A突变为G后,启动子活性明显下降,我们推测-2431位点由T突变为C,-2026位点由A突变为G碱基变异引起的启动子活性降低最终可能导致靶基因表达下调,从而影响TLR4对LPS的反应性,改变机体对感染的易感性及感染后的严重程度。
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