一个拟南芥DEAH盒RNA解旋酶AtRH59的表达纯化及活性分析

论文摘要

RNA解旋酶是在RNA转录后加工过程中起修饰作用的一种酶，其主要功能是利用NTP水解产生的能量修饰RNA的结构。在不同的生物体内都已经证实了RNA解旋酶的存在，RNA解旋酶可以调控RNA转录、mRNA剪切、RNA降解、蛋白质翻译、核糖体发生和组装等与RNA有关的生命活动。近年来，RNA解旋酶在动植物中功能的研究已经成为热点。前期工作中，本实验室分离了一个编码拟南芥DEAH-box家族蛋白的基因AtRH59的T-DNA插入突变体（atrh59）。该基因的突变导致雌配子体发育迟缓，不能完成正常的受精过程。氨基酸序列分析表明，AtRH59编码一个DEAH-box RNA解旋酶，该蛋白与酵母中参与核糖体小亚基合成和18S rRNA前体剪接的Prp22p具有很高的同源性。因此，我们推测AtRH59可能参与rRNA的剪接、修饰，进而调控雌配子体的发育。目前对DEAD-box型RNA解旋酶的生化活性已有相关报道，而DEAH-box型RNA解旋酶的活性还未有研究。本研究中，我们对一个含有DEAH box可能的RNA解旋酶AtRH59的基因进行克隆，对其蛋白进行表达和纯化，通过活性的初步检测，我们发现：（1）氨基酸序列分析表明，AtRH59蛋白靠近氨基酸N端区域中包含RNA解旋酶所特有的八个保守基序Ⅰ、Ⅰa、Ⅰb、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ，因此，AtRH59具有解旋酶家族蛋白的基本特征。（2）酶活性检测表明，AtRH59具有ATPase活性和依赖于ATP的解dsRNA和dsDNA链的活性，且解链活性受Mg2+浓度的影响。（3）利用不同结构的dsRNA和dsDNA底物检测AtRH59的解链活性。实验结果表明，AtRH59既能从3’→5’方向开始解旋，也能从5’→3’方向开始解旋，但对平末端的核苷酸双链几乎没有解旋活性。另外，进一步研究发现AtRH59具有微弱的解链极性，能够优先沿3’→5’方向进行解旋。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 前言
• 1.1 解旋酶的定义、结构和分类
• 1.1.1 解旋酶的定义
• 1.1.2 解旋酶的结构
• 1.1.3 解旋酶的分类
• 1.2 解旋酶的生化特性
• 1.3 解旋酶的作用机制
• 1.4 解旋酶的生物学功能
• 1.4.1 前体 mRNA 的剪接
• 1.4.2 核糖体的生物合成
• 1.4.3 RNA 运输
• 1.4.4 转录调控
• 1.4.5 翻译起始
• 1.4.6 RNA 降解
• 1.5 解旋酶基因的研究进展
• 1.5.1 解旋酶基因在动物中的研究进展
• 1.5.2 解旋酶基因在植物中的研究进展
• 1.6 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和质粒
• 2.1.3 工具酶及生化试剂
• 2.1.4 主要实验仪器
• 2.1.5 PCR 引物
• 2.2 主要试剂的配制
• 2.2.1 碱裂解法提取质粒相关溶液的配制
• 2.2.2 SDS-PAGE 缓冲液的配制
• 2.2.3 蛋白提纯过程中相关溶液的配制
• 2.2.4 亲和层析中相关溶液的配制
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 拟南芥幼苗培养及种植
• 2.3.2 表达载体的构建
• 2.3.2.1 植物组织总 RNA 的提取
• 2.3.2.2 反转录 cDNA 第一条链的合成
• 2.3.2.3 PCR 扩增
• 2.3.2.4 AtRH59 基因的 PCR 扩增及其产物的回收
• 2.3.2.5 连接反应
• 2.3.2.6 感受态大肠杆菌 DH5α的制备
• 2.3.2.7 连接产物的转化
• 2.3.2.8 质粒 DNA 的酶切鉴定
• 2.3.2.9 DNA 序列测定
• 2.3.3 原核表达载体的构建
• 2.3.4 E.coli BL21 的诱导表达
• 2.3.5 聚丙烯凝胶电泳
• 2.3.6 原核表达蛋白 AtRH59 的纯化
• 2.3.6.1 粗酶液的制取
• 2.3.6.2 亲和层析纯化
• 2.3.6.3 AtRH59 蛋白纯度及分子量的测定
• 2.3.7 AtRH59 的活性测定
• 2.3.7.1 dsDNA、dsRNA 底物的制备
• 2.3.7.2 蛋白质浓度的测定
• 2.3.7.3 ATPase 活性检测原理及过程
• 2.3.7.4 解旋酶活性检测原理及过程
• 3 结果与分析
• 3.1 AtRH59 基因的扩增、克隆及序列测定
• 3.1.1 AtRH59 基因的 PCR 扩增
• 3.1.2 AtRH59 基因扩增产物的克隆及序列分析
• 3.2 AtRH59 基因翻译产物的分子结构特征与功能预测分析
• 3.3 AtRH59 基因原核表达载体的构建和鉴定
• 3.3.1 AtRH59 基因原核表达载体的构建
• 3.3.2 AtRH59 基因原核表达载体的鉴定
• 3.4 AtRH59 蛋白的诱导表达及影响其表达量的因素分析
• 3.4.1 AtRH59 蛋白的表达分析
• 3.4.2 诱导表达条件对 AtRH59 表达量的影响
• 3.4.2.1 诱导时间对 AtRH59 表达量的影响
• 3.4.2.2 诱导温度对 AtRH59 表达量的影响
• 3.4.2.3 诱导剂浓度对 AtRH59 表达量的影响
• 3.5 目的蛋白 AtRH59 的可溶性分析及纯化
• 3.5.1 目的蛋白 AtRH59 的可溶性分析
• 3.5.2 目的蛋白 AtRH59 的纯化
• 3.6 AtRH59 的活性分析
• 3.6.1 dsDNA、dsRNA 底物的制备
• 3.6.2 AtRH59 解 dsRNA 链活性的检测
• 3.6.3 AtRH59 解 dsRNA 链极性的分析
• 3.6.4 AtRH59 解 dsDNA、dsRNA 链能力的比较
• 3.6.5 AtRH59 的 ATPase 活性检测
• 3.7 影响 AtRH59 解链活性因素分析
• 3.7.1 ATP 对 AtRH59 解旋活性的影响
• 3.7.2 Mg2+浓度对 AtRH59 解旋活性的影响
• 3.7.3 温度对 AtRH59 解旋活性的影响
• 4 讨论
• 4.1 AtRH59 与其它 DEAD-box 解旋酶的分子结构比较分析
• 4.2 AtRH59 蛋白表达和纯化条件的优化
• 4.3 AtRH59 活性的分析
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读学位期间发表论文情况