人精子携带的HBs和HBc基因在早期胚胎细胞中的蛋白表达

论文摘要

【背景与目的】乙型肝炎是危害人类健康的全球性疾病。由于该病流行面广,危害性大,因此其传播途径的研究一直是各国政府和科学家们高度重视的课题。1985年Hadchouel等提出“乙肝病毒有可能通过生殖细胞垂直传播”的假设。但由于没有合适的动物模型和细胞培养系统,10多年过去了没有人能证实这个假设。理论上,用乙肝患者的精子与正常人卵母细胞受精,研究从精子、受精到胚胎发育各阶段中HBV基因的行为是最理想的途径,但这条途径既存在法律、伦理问题,也存在获取人卵母细胞的困难。2002年,黄建民等引入了在生殖医学领域中广泛用于检测人精子受精能力的异种体外受精实验系统,应用荧光原位杂交技术（FISH）首次提供了HBV DNA在人精子染色体上整合的直接证据,证实了携带HBV基因的人精子在受精时不会受到选择性淘汰,能够与卵母细胞正常地完成受精过程。继后,Ali等应用同样的异种体外受精实验系统,获得2-细胞胚胎,用FISH技术证实了整合在人精子基因组中的HBx基因进入受精卵后,能随胚胎细胞分裂而复制;用RT-PCR技术证实了由人精子携带的HBx、HBs和HBc基因能够在胚胎细胞中转录。但是人精子携带的乙肝病毒基因在胚胎细胞中能否在蛋白水平表达,迄今为止未见文献报道。本研究以此为目的进行了研究。【材料与方法】1)材料①pIRES2-EGFP-HBV重组质粒;②精子,取自健康男性自愿者;③卵母细胞,取自成熟雌性金黄地鼠。2)方法①用pIRES2-EGFP-HBV转染的人精子和地鼠去透明带卵母细胞离体受精并继续培养至2-细胞胚胎;②在荧光显微镜下收集带有绿色荧光的2-细胞胚胎,此类胚胎表示含有由精子带入的HBV基因。③制备精子核、受精卵雄原核和带绿色荧光的2-细胞胚间期核制片,用FISH检测在上述样本中是否有HBs与HBc DNA阳性杂交信号;④收集带绿色荧光的2-细胞期胚胎,用免疫荧光技术检测HBs和HBc基因在胚胎细胞中的蛋白表达及大致细胞定位。⑤收集带绿色荧光的2-细胞胚,用ELISA方法分别对乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen, HBsAg）和乙肝核心抗原（hepatitis B core antigen, HBcAg）进行半定量和定性分析。【结果】①FISH:在精子核和2-细胞胚两个间期核内均观察到HBs与HBc DNA阳性杂交信号;②免疫荧光检测:在2-细胞胚细胞浆内观察到HBsAg和HBcAg阳性表达。HBsAg位于胞浆内靠近胞膜,HBcAg位于胞浆内。③ELISA:单个2-细胞胚内HBsAg的量小于0.064 ng/ml,对HBcAg的检测得到阳性结果。【结论】①HBs和HBc DNA能整合到人精子基因组内;②通过受精,整合在精子基因组中的HBs和HBc基因被带入受精卵内,并在胚胎细胞中复制;③由人精子带入受精卵内的HBs和HBc基因可在早期胚胎细胞中表达HBsAg和HBcAg。④本研究为HBV经人精子在父婴间垂直传播新途径的研究提供了病毒蛋白表达方面的实验证据。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 主要缩略语
• 前言
• 技术路线
• 材料与方法
• 1 材料
• 2 方法
• 2.1 样本及实验动物处理
• 2.2 质粒与探针的制备
• 2.3 实验程序
• 实验结果
• 1. 2-细胞胚的收集
• 2. FISH 结果
• 3. 2-细胞胚免疫荧光检测结果
• 4. ELISA 结果
• 讨论
• 1. HBV 结构及致病机制
• 2. 精子介导的 HBs 和 HBc 基因在胚胎细胞中的复制
• 3. 精子介导的 HBs 和 HBc 基因在胚胎细胞中蛋白水平的表达
• 全文小结
• 参考文献
• 综述
• 附录：主要混合液及培养基
• 致谢
• 个人简历